Acción de la progesterona sobre el endometrio del SOP

PACIENTES Y MÉTODOS

Sujetos Los criterios de inclusión para mujeres con SOP serán: a) edades de 18 a 35 años, yb) SOP fue definido por los criterios de Rotterdam, que incluye dos de las siguientes tres características: a) oligoamenorrea; b) signos clínicos o bioquímicos de hiperandrogenismo; yc) ovarios poliquísticos (6). Estos criterios producen cuatro fenotipos de PCOS (A a D) (1-3). Los controles se reclutaron en el consultorio ambulatorio de planificación familiar. Todas las participantes serán mujeres sanas de 18 a 35 años con ciclos menstruales regulares, sin evidencia de hirsutismo, sin comorbilidades y que no hayan usado medicamentos hormonales en los 3 meses anteriores.

Los criterios de exclusión son los siguientes: a) uso de cualquier tratamiento hormonal en los 3 meses anteriores; b) otras causas de anovulación evidenciadas por niveles anormales de prolactina, cortisol, sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS), 17-hidroxiprogesterona (17-OHP), androstenediona, hormona estimulante de la tiroides (TSH) y T4 libre, en muestras de sangre obtenidas entre los días 2 y 5 del ciclo en sujetos ciclistas o cualquier otro día en sujetos amenorreicos; c) trastornos ginecológicos u otras enfermedades asociadas, como endometriosis, hipertensión o diabetes mellitus; d) hormona estimulante del folículo (FSH) >15 UI/L (ciclo días 2-5); oe) una subunidad β positiva de gonadotropina coriónica humana (β-HCG).

Protocolo de estudio

Este ensayo fue previamente aprobado por el Comité de Ética en Investigación (#21253613.6.0000.0068) de la Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brasil. Los pacientes serán evaluados en la consulta externa de Ginecología. Los pacientes se dividirán en dos grupos: a) PCOS yb) controles. Todos los sujetos serán atendidos en la Sección de Endocrinología Ginecología y Centro de Reproducción Humana de la División de Ginecología del Hospital das Clínicas, FMUSP. Después de firmar el consentimiento informado será escrito de acuerdo con la Resolución 196/96 del Consejo Nacional de Salud (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), todos los sujetos serán incluidos en el estudio y evaluados de la siguiente manera:

Preselección: Esta visita incluye lo siguiente: entrevista para antecedentes médicos; exámenes físicos y ginecológicos generales; medición de peso (balanza Filizola, modelo PL-150, con capacidad para 150 kg); medición de altura con un estadiómetro de metal unido a la escala; medición de la circunferencia abdominal (CA) con una cinta métrica en la región más estrecha entre el último arco costal y la cresta ilíaca; circunferencia de la cadera (HC) medida alrededor de la circunferencia de las caderas en la parte superior de la cresta ilíaca y las nalgas, medición del índice de masa corporal (IMC) y la presión arterial (PA); hirsutismo según el sistema de puntuación modificado de Ferriman-Gallwey (mFG) con nueve áreas, considerándose hirsutos los pacientes con una puntuación superior a 8.

El ciclo menstrual se considera normal cuando el intervalo entre períodos fue de 21 a 35 días, y el flujo sanguíneo no duró más de 7 días. El ciclo se caracterizó como anovulatorio cuando el lapso entre flujos sanguíneos fue >35 días (1). La amenorrea se define como la ausencia de flujo menstrual por un período correspondiente a los tres ciclos anteriores o por > 90 días (1,20).

Se recolectarán muestras de sangre y se realizará una ecografía pélvica transvaginal en todos los sujetos del estudio.

Estudio A: A seis pacientes con SOP con amenorrea (ciclos >90 días) y β-HCG negativa se les recetará diariamente P4 micronizado (400 mg) administrado por vía vaginal durante 10 días. Se realizarán dos biopsias de endometrio, una entre el día 5 y 9 y otra entre el día 21 y 24 (bajo el segundo ciclo de tratamiento con P4) del ciclo menstrual (siendo el día 1 el primer día de sangrado vaginal). Se repetirá una tercera biopsia en el 4º ciclo de tratamiento con P4, entre los días 21 y 24 del ciclo (fig. 2). Esta parte del estudio se diseñará para evaluar si P4 podría transformar el endometrio proliferativo en secretor, independientemente del número de ciclos de tratamiento.

Estudio B:

PCOS: diecisiete pacientes con PCOS se sometieron a dos biopsias endometriales después del primer ciclo tratado con P4, la primera entre los días 5 y 9 del ciclo y la otra entre los días 20 y 22 (es decir, bajo tratamiento con P4) del ciclo.

Controles: Trece mujeres con control ovulatorio bajo dos biopsias endometriales, se realizarán después del primer mes de tratamiento con P4 luteínica, la primera entre los días 5-9 y la segunda entre los días 20-22 del ciclo.

Ensayos La prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) consistió en 75 gramos de glucosa administrados por vía oral después de tres días de una dieta rica en carbohidratos; Se extrajeron muestras de sangre para mediciones de glucosa e insulina antes de la administración de la solución de glucosa y 30, 60, 90 y 120 minutos después de tomar la solución de glucosa.

La concentración de glucosa en plasma se determinó por el método de glucosa oxidasa. Todas las mediciones de lípidos se tomaron directamente en las muestras de plasma. El colesterol total y los triglicéridos se evaluaron mediante métodos enzimáticos (Laboratorios Roche). El HDL-C se cuantificó por el mismo método y el LDL-C se estimó con la fórmula de Friedwald. La hemoglobina glicosilada se midió mediante cromatografía líquida de alta resolución (con el uso del método Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer en 2003-2004 y el método Tosoh G7 en 2007-2008, Tosoh Corp).

Para los análisis hormonales, las muestras de sangre se procesaron en una centrífuga. La progesterona se midió mediante el ensayo inmunofluorométrico (Wallac, Finlandia) utilizando kits Auto DELFIA; androstenediona, PRL, LH y FSH, por ensayo inmunofluorométrico; sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS), por radioinmunoensayo (Cisbio International, Francia y DSL, Texas, EE. UU.); e insulina y 17-OHP, por radioinmunoensayo usando kits DSL. Los niveles de testosterona y SHBG se midieron mediante el inmunoensayo electroquimioluminiscente (Modular, Roche). El índice de testosterona libre se calculó con base en la siguiente fórmula: testosterona total/SHBG*100. La testosterona libre se calculó mediante la fórmula de Vermeulen. Todos los análisis se realizaron dos veces y los coeficientes de variación intraensayo e interensayo no superaron el 10 % y el 15 %, respectivamente.

Biopsias endometriales Las muestras endometriales se obtendrán utilizando el catéter Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, París, Francia). Parte del material se embebió en parafina para análisis histomorfométricos e inmunohistoquímicos, y el resto se conservó en ARN para análisis moleculares posteriores.

Histoquímica Las muestras endometriales se fijarán durante 24 horas. en formaldehído al 10%, deshidratado en concentraciones crecientes de alcohol etílico, aclarado en xileno y luego incrustado en parafina. Las muestras incluidas en parafina se cortarán luego en diez secciones de 3 μm por sujeto. Ocho de estas secciones se tiñeron para el factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGF-C) y para la inmunohistoquímica (ver más abajo), y las dos secciones restantes se tiñerán con hematoxilina y eosina (H&E) para confirmar la fase del ciclo menstrual utilizando los criterios sugeridos. por Noyes et al. (1953) y morfometría (ver más abajo).

Las secciones se desparafinarán de forma convencional; Se utilizará H2O2 al 0,3 % para inactivar la peroxidasa endógena a temperatura ambiente durante 10 min, seguido de tres lavados con agua destilada. Las secciones se sumergieron en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) y luego se colocaron en un horno de microondas para calentar hasta el punto de ebullición. Después de 10 min, este proceso se repetirá dos veces; luego, las secciones se enfriaron a temperatura ambiente y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4). Se añadió una solución bloqueadora de albúmina de suero bovino (BSA) al 5% a temperatura ambiente durante 20 min y se descartó el exceso de líquido. Se agregaron anticuerpos policlonales de conejo anti-VEGF-C humano (Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU.) (VEGF-C: diluido a 1:100) a la incubación a 37 °C durante 24 h, y luego se lavaron las secciones 5 minutos. tres veces. Se agregará una solución de trabajo de IgG anti-conejo de cabra biotinilada (Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU.) a una dilución de 1:1000 para la incubación a 37 °C durante 20 min. Después del lavado, se agregará SABC a la incubación a 37 °C durante 20 min, seguido de lavado y desarrollo de color mediante diaminobencidina (DAB) (kit de desarrollo de color DAB, Dako, Dinamarca) a temperatura ambiente durante 5 a 30 min., seguido mediante lavado con agua destilada, hematoxilina retinción, deshidratación mediante etanol graduado, transparencia mediante xileno, sellado mediante goma neutra e inspección al microscopio óptico. El anticuerpo primario se reemplazó con PBS como control negativo. Las secciones positivas que se tiñeron satisfactoriamente en el pre-experimento se usaron como controles positivos.

Análisis morfológico e histomorfométrico Para cuantificar los parámetros de interés, se capturaron imágenes utilizando una cámara de alta resolución (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) adaptada a un microscopio óptico (Axiolab, Carl Zeiss) y ajustada con lentes objetivo de 40x. Las imágenes se transmitieron a una computadora con el software AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). Para la evaluación del espesor del epitelio superficial y glandular, el recuento de células y el recuento de vasos sanguíneos recién formados, se tomaron diez imágenes de cada muestra de endometrio para cada paciente. Para la determinación de VEGF-C se establecerá la densidad numérica de vasos sanguíneos por mm2.

Análisis estadísticos El tamaño de muestra mínimo necesario para cada grupo se determinará a partir de un estudio piloto con 10 mujeres por grupo después del estudio piloto. Por lo tanto, al calcular el tamaño de la muestra, se considerará la correlación entre las medidas del grupo. Para los resultados del número de glándulas endometriales, se adoptó un error tipo I del 5% y un error tipo II del 20% (muestra con 0,8% de poder) para la detección de >20% de diferencia entre grupos. De acuerdo con la homogeneidad, los datos cuantitativos se expresarán como media ± desviación estándar. De acuerdo con la distribución de datos, se utilizará la prueba t de Student o la prueba U de Mann-Whitney. El nivel de significancia se fijó en 95% (α ≤ 5%). Además, se utilizará ANOVA o la prueba de Kruskal-Wallis para las comparaciones histológicas e inmunohistoquímicas, cuando se incluyera el grupo adicional (SOP durante la fase proliferativa). Luego, de acuerdo con la distribución de datos, se aplicará la prueba de Tukey o la prueba de Dunn. Cuando fue posible, los sujetos del Estudio A y B se combinaron para el análisis.