Działanie progesteronu na endometrium PCOS

PACJENCI I METODY

Kryteriami włączenia dla kobiet z PCOS będą: a) wiek od 18 do 35 lat, oraz b) PCOS zdefiniowano według kryteriów rotterdamskich, które obejmują dwie z następujących trzech cech: a) rzadki brak miesiączki; b) kliniczne lub biochemiczne objawy hiperandrogenizmu; oraz c) policystycznych jajników (6). Te kryteria dają cztery fenotypy PCOS (od A do D) (1-3). Kontrole rekrutowano z poradni planowania rodziny. Wszystkie uczestniczki będą zdrowymi kobietami w wieku od 18 do 35 lat z regularnymi cyklami miesiączkowymi, bez objawów hirsutyzmu, bez chorób współistniejących i niestosujących leków hormonalnych w ciągu ostatnich 3 miesięcy.

Kryteria wykluczenia są następujące: a) stosowanie jakiejkolwiek terapii hormonalnej w ciągu ostatnich 3 miesięcy; b) inne przyczyny braku owulacji potwierdzone nieprawidłowym poziomem prolaktyny, kortyzolu, siarczanu dehydroepiandrosteronu (DHEAS), 17-hydroksyprogesteronu (17-OHP), androstendionu, hormonu tyreotropowego (TSH) i wolnej T4 w próbkach krwi pobranych między 2. i 5. dzień cyklu u osób jeżdżących na rowerze lub w dowolnym innym dniu u osób z brakiem miesiączki; c) zaburzenia ginekologiczne lub inne powiązane choroby, takie jak endometrioza, nadciśnienie lub cukrzyca; d) hormon folikulotropowy (FSH) >15 UI/L (2-5 dni cyklu); lub e) dodatnią podjednostkę β ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (β-HCG).

Protokół badania

To badanie zostało wcześniej zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Badań (nr 21253613.6.0000.0068) Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brazylia. Pacjentki będą badane w Poradni Ginekologicznej. Pacjentki zostaną podzielone na dwie grupy: a) PCOS ib) kontrolna. Wszystkie pacjentki będą objęte opieką w Sekcji Ginekologii Endokrynologicznej i Centrum Rozrodu Człowieka Oddziału Ginekologii Hospital das Clínicas, FMUSP. Po podpisaniu świadoma zgoda zostanie sporządzona zgodnie z Uchwałą 196/96 Krajowej Rady Zdrowia (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), wszyscy uczestnicy zostaną włączeni do badania i ocenieni w następujący sposób:

Preselekcja: Ta wizyta obejmuje: wywiad w celu uzyskania historii medycznej; ogólne badania fizykalne i ginekologiczne; pomiar masy ciała (waga Filizola model PL-150 o nośności 150 kg); pomiar wysokości za pomocą metalowego stadiometru przymocowanego do wagi; pomiar obwodu brzucha (AC) miarką w najwęższym odcinku między ostatnim łukiem żebrowym a grzebieniem biodrowym; obwód bioder (HC) mierzony w obwodzie bioder u szczytu grzebienia biodrowego i pośladków, pomiar wskaźnika masy ciała (BMI) oraz ciśnienia krwi (BP); hirsutyzm według zmodyfikowanego systemu punktacji Ferrimana-Gallweya (mFG) z dziewięcioma obszarami, przy czym pacjenci z wynikiem wyższym niż 8 punktów uznawani są za owłosionych.

Cykl miesiączkowy uważa się za prawidłowy, gdy przerwa między miesiączkami wynosiła od 21 do 35 dni, a przepływ krwi trwał nie dłużej niż 7 dni. Cykl charakteryzowano jako bezowulacyjny, gdy odstęp między kolejnymi przepływami krwi wynosił >35 dni (1). Brak miesiączki definiuje się jako brak miesiączki przez okres odpowiadający trzem poprzednim cyklom lub przez >90 dni (1,20).

U wszystkich badanych zostanie pobrana krew i wykonane przezpochwowe USG miednicy.

Badanie A: Sześciu pacjentkom z PCOS z brakiem miesiączki (cykle >90 dni) i ujemnym wynikiem oznaczenia β-HCG zostanie przepisane codzienne mikronizowane P4 (400 mg) podawane dopochwowo przez 10 dni. Zostaną wykonane dwie biopsje endometrium, jedna między 5 a 9 dniem i druga między 21 a 24 dniem (w ramach drugiego cyklu leczenia P4) cyklu miesiączkowego (dzień 1 to pierwszy dzień krwawienia z pochwy). Trzecia biopsja zostanie powtórzona w 4. cyklu leczenia P4, między 21. a 24. dniem cyklu (ryc. 2). Ta część badania będzie miała na celu ocenę, czy P4 może przekształcić endometrium proliferacyjne w wydzielnicze, niezależnie od liczby cykli leczenia.

Badanie B:

PCOS: Siedemnaście pacjentek z PCOS przeszło dwie biopsje endometrium po pierwszym cyklu leczenia P4, pierwszą między 5-9 dniem cyklu, a drugą między 20-22 dniem (tj. w trakcie leczenia P4) cyklu.

Kontrole: Trzynaście kobiet z grupy kontrolnej owulacji, pod dwiema biopsjami endometrium, zostanie wykonanych po pierwszym miesiącu leczenia lutealną P4, pierwsza między 5-9 a druga między 20-22 dniem cyklu.

Testy Doustny test tolerancji glukozy (OGTT) składał się z 75 gramów glukozy podanych doustnie po trzech dniach diety bogatej w węglowodany; próbki krwi do pomiarów glukozy i insuliny pobierano przed podaniem roztworu glukozy oraz 30, 60, 90 i 120 minut po przyjęciu roztworu glukozy.

Stężenie glukozy w osoczu oznaczano metodą oksydazy glukozowej. Wszystkie pomiary lipidów wykonano bezpośrednio w próbkach osocza. Cholesterol całkowity i trójglicerydy oznaczano metodami enzymatycznymi (Roche Laboratories). HDL-C oznaczono ilościowo tą samą metodą, a LDL-C oszacowano za pomocą wzoru Friedwalda. Hemoglobinę glikowaną oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (metodą Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobina Analyzer w latach 2003-2004 oraz metodą Tosoh G7 w latach 2007-2008, Tosoh Corp).

Do analiz hormonalnych próbki krwi przetwarzano w wirówce. Progesteron mierzono za pomocą testu immunofluorometrycznego (Wallac, Finlandia) przy użyciu zestawów Auto DELFIA; androstendion, PRL, LH i FSH w teście immunofluorometrycznym; siarczan dehydroepiandrosteronu (DHEAS), testem radioimmunologicznym (Cisbio International, Francja i DSL, Teksas, USA); oraz insulinę i 17-OHP, w teście radioimmunologicznym z użyciem zestawów DSL. Poziomy testosteronu i SHBG mierzono stosując elektrochemiluminescencyjny test immunologiczny (Modular, Roche). Wskaźnik wolnego testosteronu obliczono na podstawie następującego wzoru: testosteron całkowity/SHBG*100. Wolny testosteron obliczono ze wzoru Vermeulena. Wszystkie analizy przeprowadzono dwukrotnie, a współczynniki zmienności wewnątrz i między testami nie przekraczały odpowiednio 10% i 15%.

Biopsje endometrium Próbki endometrium będą pobierane przy użyciu cewnika Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Paryż, Francja). Część materiału zatopiono w parafinie do analiz histomorfometrycznych i immunohistochemicznych, a pozostałą część zakonserwowano w RNA do późniejszych analiz molekularnych.

Histochemia Próbki endometrium będą utrwalane przez 24 godziny. w 10% formaldehydzie, odwodniony we wzrastających stężeniach alkoholu etylowego, klarowany w ksylenie, a następnie zatopiony w parafinie. Próbki zatopione w parafinie zostaną następnie pocięte na dziesięć skrawków o grubości 3 μm na osobę. Osiem z tych skrawków barwiono pod kątem czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego C (VEGF-C) i immunohistochemicznie (patrz poniżej), a dwa pozostałe skrawki będą barwione hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu potwierdzenia fazy cyklu miesiączkowego przy użyciu sugerowanych kryteriów przez Noyesa i in. (1953) i morfometrię (patrz poniżej).

Skrawki zostaną odparafinowane konwencjonalnie; 0,3% H2O2 zostanie użyte do inaktywacji endogennej peroksydazy w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie trzykrotnie przemyte wodą destylowaną. Skrawki zanurzono w 0,01 M buforze cytrynianowym (pH 6,0), a następnie umieszczono w kuchence mikrofalowej w celu ogrzania do temperatury wrzenia. Po 10 minutach proces ten zostanie powtórzony dwukrotnie; następnie skrawki ochłodzono do temperatury pokojowej i przemyto dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (pH 7,4). Dodano 5% roztwór blokujący albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze pokojowej na 20 minut i nadmiar cieczy odrzucono. Królicze przeciwciała poliklonalne przeciw ludzkiemu VEGF-C (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: rozcieńczone w stosunku 1:100) dodano do inkubacji w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie skrawki przemyto przez 5 minut. trzykrotnie. Roztwór roboczy biotynylowanej koziej anty-króliczej IgG (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) zostanie dodany w rozcieńczeniu 1:1000 do inkubacji w 37°C przez 20 min. Po przemyciu SABC zostanie dodany do inkubacji w temperaturze 37°C przez 20 min, a następnie wypłukany i wywołany kolorem przez diaminobenzydynę (DAB) (zestaw do wywoływania koloru DAB, Dako, Dinamarca) w temperaturze pokojowej przez 5 do 30 min., a następnie przez przemywanie wodą destylowaną, ponowne barwienie hematoksyliną, odwodnienie stopniowanym etanolem, przezroczystość za pomocą ksylenu, uszczelnienie za pomocą neutralnej gumy i badanie pod mikroskopem świetlnym. Pierwotne przeciwciało zastąpiono PBS jako kontrolę negatywną. Skrawki pozytywne, które wybarwiły się zadowalająco w eksperymencie wstępnym, zastosowano jako kontrole pozytywne.

Analizy morfologiczne i histomorfometryczne Aby określić ilościowo interesujące nas parametry, obrazy rejestrowano za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) przystosowanej do mikroskopu świetlnego (Axiolab, Carl Zeiss) i wyregulowanej za pomocą obiektywów 40×. Obrazy przesłano do komputera z oprogramowaniem AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). W celu oceny grubości nabłonka gruczołowego i powierzchniowego, liczby komórek i zliczenia nowo utworzonych naczyń krwionośnych wykonano dziesięć obrazów każdej próbki endometrium dla każdej pacjentki. W celu oznaczenia VEGF-C zostanie ustalona liczbowa gęstość naczyń krwionośnych na mm2.

Analizy statystyczne Minimalna wielkość próby potrzebna dla każdej grupy zostanie określona na podstawie badania pilotażowego z 10 kobietami na grupę po badaniu pilotażowym. Zatem przy obliczaniu wielkości próby zostanie uwzględniona korelacja między pomiarami grupowymi. Dla wyników liczby gruczołów endometrialnych przyjęto błąd I rodzaju wynoszący 5% i błąd II rodzaju wynoszący 20% (próbka o mocy 0,8%) dla wykrycia >20% różnicy między grupami. Współmiernie do jednorodności dane ilościowe zostaną wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe. Zgodnie z dystrybucją danych zastosowany zostanie test t Studenta lub test U Manna-Whitneya. Poziom istotności ustalono na 95% (α ≤ 5%). Ponadto ANOVA lub test Kruskala-Wallisa zostaną wykorzystane do porównań histologicznych i immunohistochemicznych, gdy uwzględniona zostanie dodatkowa grupa (PCOS w fazie proliferacyjnej). Następnie, zgodnie z rozkładem danych, zastosowany zostanie test Tukeya lub test Dunna. Jeśli to możliwe, osoby z badania A i B zostały połączone do analizy.