Progesteronvirkning på endometrium av PCOS

PASIENTER OG METODER

Inklusjonskriterier for PCOS-kvinner vil være: a) i alderen 18 til 35 år, og b) PCOS ble definert av Rotterdam-kriteriene, som inkluderer to av følgende tre funksjoner: a) oligo-amenoré; b) kliniske eller biokjemiske tegn på hyperandrogenisme; og c) polycystiske eggstokker (6). Disse kriteriene gir fire PCOS-fenotyper (A til D) (1-3). Kontroller ble rekruttert fra familieplanleggingspoliklinikken. Alle deltakerne vil være friske kvinner i alderen 18 til 35 år med regelmessige menstruasjonssykluser, ingen tegn på hirsutisme, ingen komorbiditeter og ikke brukt hormonmedisiner de siste 3 månedene.

Eksklusjonskriterier er som følger: a) bruk av hormonbehandling de siste 3 månedene; b) andre årsaker til anovulasjon som påvist ved unormale nivåer av prolaktin, kortisol, dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), 17-hydroksyprogesteron (17-OHP), androstenedion, thyreoideastimulerende hormon (TSH), og fritt T4, i blodprøver tatt mellom kl. dag 2 og 5 av syklusen hos syklister eller på en hvilken som helst annen dag hos amenoréiske; c) gynekologiske lidelser eller andre assosierte sykdommer, slik som endometriose, hypertensjon eller diabetes mellitus; d) follikkelstimulerende hormon (FSH) >15 UI/L (syklusdager 2-5); eller e) en positiv β-subenhet av humant koriongonadotropin (β-HCG).

Studieprotokoll

Denne utprøvingen ble tidligere godkjent av forskningsetisk komité (#21253613.6.0000.0068) ved Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brasil. Pasientene vil bli evaluert ved Gynekologisk poliklinikk. Pasientene vil bli delt inn i to grupper: a) PCOS og b) kontroller. Alle fagene vil bli tatt hånd om ved Endokrinologisk gynekologisk seksjon og Human Reproductive Center i Gynecology Division, Hospital das Clínicas, FMUSP. Etter signering av informert samtykke vil bli skrevet i samsvar med resolusjon 196/96 fra National Health Board (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), alle emner vil bli inkludert i studien og evaluert som følger:

Forhåndsvalg: Dette besøket inkluderer følgende: intervju for medisinsk historie; generelle fysiske og gynekologiske undersøkelser; vektmåling (skala Filizola, modell PL-150, med en kapasitet på 150 kg); høydemåling med et metallstadiometer festet til skalaen; abdominal omkrets (AC) måling med et målebånd i det smaleste området mellom siste kystbue og hoftekammen; hofteomkrets (HC) målt rundt omkretsen av hofter på toppen av hoftekammen og rumpa, kroppsmasseindeks (BMI) og blodtrykksmåling (BP); hirsutisme i henhold til det modifiserte Ferriman-Gallwey (mFG) skåringssystemet med ni områder, med pasienter med en skåre høyere enn 8 skåre ansett som hirsut.

Menstruasjonssyklusen anses som normal når intervallet mellom menstruasjonene var 21 til 35 dager, og blodstrømmen varte ikke mer enn 7 dager. Syklusen ble karakterisert som anovulatorisk når spennet mellom blodstrømmene var >35 dager (1). Amenoré er definert som fravær av menstruasjonsstrøm i en periode som tilsvarer de tre foregående syklusene eller i >90 dager (1,20).

Blod vil bli samlet og en transvaginal bekkenultralyd vil bli utført på alle studieobjektene.

Studie A: Seks PCOS-pasienter med amenoré (sykluser >90 dager) og negativ β-HCG vil bli foreskrevet daglig mikronisert P4 (400 mg) administrert via vaginal rute i 10 dager. To endometriebiopsier vil bli utført, en mellom 5. og 9. dag og den andre mellom 21. og 24. dag (under den andre behandlingssyklusen med P4) i menstruasjonssyklusen (dag 1 er den første dagen med vaginal blødning). En tredje biopsi vil bli gjentatt i 4. syklus av P4-behandling, mellom syklusdag 21 og 24 (fig. 2). Denne delen av studien vil bli designet for å vurdere om P4 kan transformere proliferativ til sekretorisk endometrium, uavhengig av antall behandlingssykluser.

Studie B:

PCOS: Sytten PCOS-personer gjennomgikk to endometriebiopsier etter den første P4-behandlede syklusen, den første mellom dag 5-9 i syklusen og den andre mellom dag 20-22 (dvs. under P4-behandling) av syklusen.

Kontroller: Tretten eggløsningskontrollkvinner under to endometriebiopsier vil bli utført etter den første måneden med luteal P4-behandling, den første mellom dag 5-9 og den andre mellom dag 20-22 av syklusen.

Analyser Den orale glukosetoleransetesten (OGTT) besto av 75 gram glukose administrert oralt etter tre dager med en karbohydratrik diett; blodprøver for glukose- og insulinmålinger ble tatt før administrering av glukoseløsningen og 30, 60, 90 og 120 minutter etter inntak av glukoseløsningen.

Plasmaglukosekonsentrasjon ble bestemt ved glukoseoksidasemetoden. Alle lipidmålinger ble tatt direkte i plasmaprøvene. Totalt kolesterol og triglyserider ble vurdert ved bruk av enzymmetoder (Roche Laboratories). HDL-C ble kvantifisert ved samme metode og LDL-C ble estimert med Friedwald-formelen. Det glykerte hemoglobinet ble målt ved hjelp av høyytelses væskekromatografi (med bruk av Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer-metoden i 2003-2004 og Tosoh G7-metoden i 2007-2008, Tosoh Corp).

For hormonanalyser ble blodprøvene behandlet i en sentrifuge. Progesteron ble målt ved immunofluorometrisk analyse (Wallac, Finland) ved bruk av Auto DELFIA-sett; androstenedion, PRL, LH og FSH, ved den immunfluorometriske analysen; dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), ved radioimmunoassay (Cisbio International, Frankrike og DSL, Texas, USA); og insulin og 17-OHP, ved radioimmunoassay ved bruk av DSL-sett. Testosteron- og SHBG-nivåene ble målt ved bruk av elektrokjemiluminescerende immunoassay (Modular, Roche). Den frie testosteronindeksen ble beregnet basert på følgende formel: totalt testosteron/SHBG*100. Fri testosteron ble beregnet etter Vermeulens formel. Alle analyser ble utført to ganger og variasjonskoeffisientene for intra-analyse og interanalyse oversteg ikke henholdsvis 10 % og 15 %.

Endometriebiopsier Endometrieprøver vil bli tatt med Pipelle de Cornier-kateteret (Laboratoire CCD, Paris, Frankrike). En del av materialet ble innebygd i parafin for histomorfometriske og immunhistokjemiske analyser, og resten ble bevart i RNA for senere molekylære analyser.

Histokjemi Endometrieprøver vil bli fikset i 24 timer. i 10 % formaldehyd, dehydrert i økende konsentrasjoner av etylalkohol, renset i xylen og deretter innebygd i parafin. De parafininnstøpte prøvene vil deretter kuttes i ti 3-μm seksjoner per emne. Åtte av disse seksjonene ble farget for vaskulær endotelial vekstfaktor C (VEGF-C) og for immunhistokjemi (se nedenfor), og de to gjenværende seksjonene vil bli farget med hematoxylin og eosin (H&E) for å bekrefte menstruasjonssyklusfasen ved å bruke de foreslåtte kriteriene av Noyes et al. (1953) og morfometri (se nedenfor).

Seksjoner vil bli avvokset konvensjonelt; 0,3 % H2O2 vil bli brukt til å inaktivere endogen peroksidase ved romtemperatur i 10 minutter, etterfulgt av vasking med destillert vann tre ganger. Seksjonene ble nedsenket i 0,01 M sitratbuffer (pH 6,0) og deretter plassert i en mikrobølgeovn for oppvarming til kokepunktet. Etter 10 minutter vil denne prosessen gjentas to ganger; deretter ble seksjonene avkjølt ved romtemperatur og vasket to ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) (pH 7,4). En 5% bovint serumalbumin (BSA) blokkerende løsning ble tilsatt ved romtemperatur i 20 minutter, og overskuddet av væske ble kastet. Kanin anti-humane VEGF-C polyklonale antistoffer (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: fortynnet ved 1:100) ble tilsatt til inkubasjonen ved 37 °C i 24 timer, og seksjonene ble deretter vasket i 5 min. tre ganger. En biotinylert geit anti-kanin IgG (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) arbeidsløsning vil bli tilsatt ved 1:1000 fortynning for inkubering ved 37 °C i 20 minutter. Etter vasking vil SABC tilsettes til inkubasjonen ved 37 °C i 20 minutter, etterfulgt av vasking og fargeutvikling via diaminobenzidin (DAB) (DAB fargeutviklingssett, Dako, Dinamarca) ved romtemperatur i 5 til 30 minutter, etterfulgt av ved vasking med destillert vann, hematoxylin re-farging dehydrering via gradert etanol, transparens via xylen, forsegling via nøytral gummi, og inspeksjon under lysmikroskop. Det primære antistoffet ble erstattet med PBS som en negativ kontroll. De positive delene som ble farget tilfredsstillende i pre-eksperimentet ble brukt som positive kontroller.

Morfologiske og histomorfometriske analyser For å kvantifisere parametrene av interesse, ble bilder tatt med et høyoppløselig kamera (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) tilpasset et lysmikroskop (Axiolab, Carl Zeiss) og justert med 40× objektivlinser. Bildene ble overført til en datamaskin med AxioVision Rel 4.2-programvare (Carl Zeiss). For vurdering av kjertel- og overflateepiteltykkelse, celletall og telling av nydannede blodkar, ble det laget ti bilder av hver endometrieprøve for hver pasient. For VEGF-C-bestemmelse vil den numeriske tettheten av blodårer per mm2 bli etablert.

Statistiske analyser Minimum prøvestørrelse for hver gruppe vil bli bestemt fra en pilotstudie med 10 kvinner per gruppe etter pilotstudie. Ved beregning av utvalgsstørrelsen vil derfor korrelasjonen mellom gruppemålingene vurderes. For resultatene av antall endometriekjertler ble en type I feil på 5 % og en type II feil på 20 % (prøve med 0,8 % kraft) tatt i bruk for påvisning av >20 % forskjell mellom gruppene. I samsvar med homogenitet vil de kvantitative dataene uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik. I samsvar med datadistribusjon vil Student t-testen eller Mann-Whitney U-testen bli brukt. Signifikansnivået ble satt til 95 % (α ≤ 5 %). Dessuten vil ANOVA eller Kruskal-Wallis-testen bli brukt for histologiske og immunhistokjemiske sammenligninger, når tilleggsgruppen (PCOS under den proliferative fasen) ble inkludert. Deretter, i tråd med datadistribusjon, vil enten Tukey-testen eller Dunn-testen bli brukt. Når det var mulig, ble emnene i studie A og B kombinert for analyse.