Действие прогестерона на эндометрий при СПКЯ

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Субъекты. Критериями включения женщин с СПКЯ будут: а) возраст от 18 до 35 лет и б) СПКЯ определялся Роттердамскими критериями, которые включают два из следующих трех признаков: а) олиго-аменорея; б) клинические или биохимические признаки гиперандрогении; и в) поликистозные яичники (6). Эти критерии дают четыре фенотипа СПКЯ (от A до D) (1-3). Контрольная группа была набрана из амбулаторного отделения планирования семьи. Все участники будут здоровыми женщинами в возрасте от 18 до 35 лет с регулярными менструальными циклами, без признаков гирсутизма, без сопутствующих заболеваний и не принимавших гормональные препараты в течение предыдущих 3 месяцев.

Критерии исключения следующие: а) использование любого гормонального лечения в течение предшествующих 3 месяцев; б) другие причины ановуляции, о чем свидетельствуют аномальные уровни пролактина, кортизола, дегидроэпиандростерона сульфата (ДГЭАС), 17-гидроксипрогестерона (17-ОНР), андростендиона, тиреотропного гормона (ТТГ) и свободного Т4 в образцах крови, полученных между во 2-й и 5-й дни цикла у циклирующих женщин или в любой другой день у женщин с аменореей; в) гинекологические расстройства или другие сопутствующие заболевания, такие как эндометриоз, гипертония или сахарный диабет; г) фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) >15 МЕ/л (2-5 дни цикла); или e) положительная β-субъединица хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ).

Протокол исследования

Это исследование было ранее одобрено Комитетом по этике исследований (№ 21253613.6.0000.0068) Медицинского факультета Клинической больницы Университета Сан-Паулу (FMUSP), Сан-Паулу, Бразилия. Пациенты будут обследованы в амбулаторном гинекологическом отделении. Пациенты будут разделены на две группы: а) СПКЯ и б) контрольная группа. Все пациенты будут лечиться в отделении эндокринологии и гинекологии и в Центре репродукции человека при отделении гинекологии клинической больницы FMUSP. После подписания информированное согласие будет написано в соответствии с резолюцией 196/96 Национального совета здравоохранения (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), все субъекты будут включены в исследование и оценены следующим образом:

Предварительный отбор: Этот визит включает в себя следующее: интервью для истории болезни; общий физикальный и гинекологический осмотры; взвешивание (весы Филизола, модель ПЛ-150, грузоподъемностью 150 кг); измерение роста металлическим ростомером, закрепленным на весах; измерение окружности живота (ОА) сантиметровой лентой в самом узком месте между последней реберной дугой и гребнем подвздошной кости; окружность бедер (ОБ), измеряемую по окружности бедер в верхней части гребня подвздошной кости и ягодиц, измерение индекса массы тела (ИМТ) и артериального давления (АД); гирсутизм в соответствии с модифицированной системой оценки Ферримана-Голлвея (mFG) с девятью областями, при этом пациенты с оценкой выше 8 баллов считаются гирсутистами.

Менструальный цикл считается нормальным, когда интервал между менструациями составляет от 21 до 35 дней, а кровотечение длится не более 7 дней. Цикл характеризовался как ановуляторный, когда интервал между кровотоками составлял >35 дней (1). Аменорея определяется как отсутствие менструальных выделений в течение периода, соответствующего трем предыдущим циклам, или в течение >90 дней (1,20).

Будет собрана кровь, и всем субъектам исследования будет проведено трансвагинальное УЗИ органов малого таза.

Исследование A: Шесть пациенток с СПКЯ с аменореей (цикл >90 дней) и отрицательным уровнем β-ХГЧ будут ежедневно назначать микронизированный Р4 (400 мг) вагинально в течение 10 дней. Будут выполнены две биопсии эндометрия, одна между 5-м и 9-м днем, а другая между 21-м и 24-м днем ​​(в рамках второго цикла лечения с P4) менструального цикла (день 1 является первым днем ​​вагинального кровотечения). Третья биопсия будет повторена в 4-м цикле лечения P4 между 21-м и 24-м днями цикла (рис. 2). Эта часть исследования будет предназначена для оценки того, может ли P4 трансформировать пролиферативный эндометрий в секреторный, независимо от количества циклов лечения.

Исследование Б:

СПКЯ: Семнадцать пациенток с СПКЯ прошли две биопсии эндометрия после первого цикла лечения P4, первая между 5-9 днями цикла, а другая между 20-22 днями (т.е. при лечении P4) цикла.

Контрольная группа: Тринадцать женщин с контрольной овуляцией после двух биопсий эндометрия будут выполнены после первого месяца лечения лютеиновым P4, первая между 5-9 днями и вторая между 20-22 днями цикла.

Анализы Пероральный тест на толерантность к глюкозе (ОГТТ) состоял из 75 граммов глюкозы, введенных перорально после трех дней богатой углеводами диеты; образцы крови для измерения уровня глюкозы и инсулина брали до введения раствора глюкозы и через 30, 60, 90 и 120 минут после приема раствора глюкозы.

Концентрацию глюкозы в плазме определяли глюкозооксидазным методом. Все измерения липидов проводились непосредственно в образцах плазмы. Общий холестерин и триглицериды оценивали с помощью ферментных методов (Roche Laboratories). HDL-C количественно определяли тем же методом, а LDL-C оценивали по формуле Фридвальда. Гликированный гемоглобин измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (с использованием метода анализатора гликогемоглобина Tosoh A1c 2.2 Plus в 2003-2004 гг. и метода Tosoh G7 в 2007-2008 гг., Tosoh Corp).

Для анализа на гормоны образцы крови обрабатывали в центрифуге. Уровень прогестерона определяли иммунофлюорометрическим методом (Wallac, Финляндия) с использованием наборов Auto DELFIA; андростендион, ПРЛ, ЛГ и ФСГ – иммунофлуориметрическим методом; дегидроэпиандростерона сульфат (ДГЭАС) с помощью радиоиммуноанализа (Cisbio International, Франция и DSL, Техас, США); и инсулин и 17-ОНР, радиоиммуноанализом с использованием наборов DSL. Уровни тестостерона и ГСПГ измеряли с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа (Modular, Roche). Индекс свободного тестостерона рассчитывали по следующей формуле: общий тестостерон/ГСПГ*100. Свободный тестостерон рассчитывали по формуле Вермюлена. Все анализы проводились дважды, и коэффициенты вариации внутри и между анализами не превышали 10% и 15% соответственно.

Биопсия эндометрия Образцы эндометрия будут получены с использованием катетера Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Париж, Франция). Часть материала заливали в парафин для гистоморфометрического и иммуногистохимического анализа, а оставшуюся часть сохраняли в РНК для последующего молекулярного анализа.

Гистохимия Образцы эндометрия фиксируются на 24 часа. в 10% формальдегиде, обезвоживают в этиловом спирте возрастающей концентрации, очищают в ксилоле, а затем заливают в парафин. Образцы, залитые парафином, затем будут разрезаны на десять срезов по 3 мкм на человека. Восемь из этих срезов были окрашены на фактор роста эндотелия сосудов С (VEGF-C) и для иммуногистохимии (см. ниже), а два оставшихся среза будут окрашены гематоксилином и эозином (H&E) для подтверждения фазы менструального цикла с использованием предложенных критериев. Нойес и др. (1953) и морфометрии (см. ниже).

Срезы будут депарафинизированы обычным способом; 0,3% H2O2 будет использоваться для инактивации эндогенной пероксидазы при комнатной температуре в течение 10 минут с последующим промыванием дистиллированной водой три раза. Срезы погружали в 0,01 М цитратный буфер (рН 6,0) и затем помещали в микроволновую печь для нагревания до температуры кипения. Через 10 мин этот процесс повторяется дважды; затем срезы охлаждали при комнатной температуре и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) (рН 7,4). Добавляли 5% блокирующий раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) при комнатной температуре на 20 мин и удаляли избыток жидкости. Поликлональные антитела кролика против VEGF-C человека (Cell Signaling, Дэнверс, Массачусетс, США) (VEGF-C: разбавленный 1:100) добавляли к инкубации при 37°C в течение 24 ч, а затем срезы промывали в течение 24 часов. 5 мин. трижды. Рабочий раствор биотинилированного козьего антикроличьего IgG (Cell Signaling, Дэнверс, Массачусетс, США) будет добавлен в разведении 1:1000 для инкубации при 37°C в течение 20 мин. После промывки SABC добавляют в инкубатор при 37°C в течение 20 минут, затем промывают и проявляют окраску с помощью диаминобензидина (DAB) (набор для проявления окраски DAB, Dako, Dinamarca) при комнатной температуре в течение 5–30 минут, а затем путем промывки дистиллированной водой, повторного окрашивания гематоксилином, обезвоживания с помощью этанола определенной степени очистки, прозрачности с помощью ксилола, герметизации с помощью нейтральной смолы и осмотра под световым микроскопом. Первичное антитело заменяли PBS в качестве отрицательного контроля. Положительные срезы, которые удовлетворительно окрашивались в предварительном эксперименте, использовали в качестве положительных контролей.

Морфологический и гистоморфометрический анализы. Для количественной оценки интересующих параметров изображения были получены с помощью камеры высокого разрешения (AxioCam-MCR, Carl Zeiss), адаптированной к световому микроскопу (Axiolab, Carl Zeiss) и скорректированной с помощью 40-кратных объективов. Изображения передавались на компьютер с программным обеспечением AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). Для оценки толщины железистого и поверхностного эпителия, количества клеток и новообразованных кровеносных сосудов каждой пациентке делали по десять изображений каждого образца эндометрия. Для определения VEGF-C будет установлена ​​числовая плотность кровеносных сосудов на мм2.

Статистический анализ Минимальный размер выборки, необходимый для каждой группы, будет определен на основе пилотного исследования с 10 женщинами в группе после пилотного исследования. Таким образом, при расчете размера выборки будет учитываться корреляция между групповыми измерениями. Для результатов количества эндометриальных желез была принята ошибка типа I в 5% и ошибка типа II в 20% (выборка с мощностью 0,8%) для обнаружения> 20% различий между группами. В соответствии с однородностью количественные данные будут выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. В соответствии с распределением данных будет использоваться t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни. Уровень значимости был установлен на уровне 95% (α ≤ 5%). Кроме того, для гистологических и иммуногистохимических сравнений будет использоваться ANOVA или тест Крускала-Уоллиса, когда была включена дополнительная группа (СПКЯ во время пролиферативной фазы). Затем, в соответствии с распределением данных, будет применяться либо тест Тьюки, либо тест Данна. Когда это было возможно, субъектов исследования A и B объединяли для анализа.