Ação da progesterona no endométrio da SOP

PACIENTES E MÉTODOS

Indivíduos Os critérios de inclusão para mulheres com SOP serão: a) idades de 18 a 35 anos, e b) SOP foi definido pelos critérios de Rotterdam, que inclui duas das três características a seguir: a) oligo-amenorreia; b) sinais clínicos ou bioquímicos de hiperandrogenismo; ec) ovários policísticos (6). Esses critérios produzem quatro fenótipos de SOP (A a D) (1-3). Os controles foram recrutados no ambulatório de planejamento familiar. Todas as participantes serão mulheres saudáveis ​​com idades entre 18 e 35 anos, com ciclos menstruais regulares, sem evidência de hirsutismo, sem comorbidades e sem uso de medicamentos hormonais nos últimos 3 meses.

Os critérios de exclusão são os seguintes: a) uso de qualquer tratamento hormonal nos últimos 3 meses; b) outras causas de anovulação evidenciadas por níveis anormais de prolactina, cortisol, sulfato de desidroepiandrosterona (DHEAS), 17-hidroxiprogesterona (17-OHP), androstenediona, hormônio estimulante da tireoide (TSH) e T4 livre, em amostras de sangue obtidas entre dias 2 e 5 do ciclo em mulheres cicladas ou em qualquer outro dia em mulheres amenorreicas; c) distúrbios ginecológicos ou outras doenças associadas, como endometriose, hipertensão ou diabetes mellitus; d) hormônio folículo-estimulante (FSH) >15 UI/L (2-5 dias do ciclo); ou e) uma subunidade β positiva da gonadotrofina coriônica humana (β-HCG).

Protocolo de estudo

Este estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (nº 21253613.6.0000.0068) da Faculdade de Medicina do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brasil. As pacientes serão avaliadas no Ambulatório de Ginecologia. As pacientes serão divididas em dois grupos: a) SOP eb) controles. Todos os sujeitos serão atendidos no Setor de Ginecologia Endocrinológica e no Centro de Reprodução Humana da Divisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da FMUSP. Após a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido de acordo com a Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), todos os sujeitos serão incluídos no estudo e avaliados da seguinte forma:

Pré-seleção: Esta visita inclui o seguinte: entrevista para histórico médico; exames físicos e ginecológicos gerais; aferição do peso (balança Filizola, modelo PL-150, com capacidade para 150 kg); aferição da estatura com estadiômetro de metal acoplado à balança; medida da circunferência abdominal (CA) com fita métrica na região mais estreita entre o último arco costal e a crista ilíaca; circunferência do quadril (CQ) medida em torno da circunferência dos quadris no topo da crista ilíaca e nádegas, medição do índice de massa corporal (IMC) e pressão arterial (PA); hirsutismo de acordo com o sistema de pontuação modificado de Ferriman-Gallwey (mFG) com nove áreas, com pacientes com pontuação superior a 8 pontos considerados hirsutos.

O ciclo menstrual é considerado normal quando o intervalo entre as menstruações foi de 21 a 35 dias, e o fluxo sanguíneo durou não mais que 7 dias. O ciclo foi caracterizado como anovulatório quando o intervalo entre os fluxos sanguíneos foi >35 dias (1). A amenorréia é definida como a ausência de fluxo menstrual por um período correspondente aos três ciclos anteriores ou >90 dias (1,20).

Sangues serão coletados e uma ultrassonografia pélvica transvaginal será realizada em todos os indivíduos do estudo.

Estudo A: Seis pacientes com SOP com amenorreia (ciclos >90 dias) e β-HCG negativo serão prescritos diariamente com P4 micronizado (400 mg) administrado por via vaginal por 10 dias. Serão realizadas duas biópsias endometriais, uma entre o 5º e o 9º dia e a outra entre o 21º e o 24º dia (no segundo ciclo de tratamento com P4) do ciclo menstrual (dia 1 sendo o primeiro dia de sangramento vaginal). Uma terceira biópsia será repetida no 4º ciclo de tratamento com P4, entre os dias 21 e 24 do ciclo (Fig. 2). Esta parte do estudo será projetada para avaliar se o P4 poderia transformar o endométrio proliferativo em secretor, independentemente do número de ciclos de tratamento.

Estudo B:

SOP: Dezessete indivíduos com SOP foram submetidos a duas biópsias endometriais após o primeiro ciclo tratado com P4, a primeira entre os dias 5-9 do ciclo e a outra entre os dias 20-22 (isto é, sob tratamento com P4) do ciclo.

Controles: Treze mulheres controle ovulatória submetidas a duas biópsias endometriais, serão realizadas após o primeiro mês de tratamento lúteo com P4, a primeira entre os dias 5-9 e a segunda entre os dias 20-22 do ciclo.

Ensaios O teste oral de tolerância à glicose (OGTT) consistiu de 75 gramas de glicose administrados por via oral após três dias de uma dieta rica em carboidratos; amostras de sangue para medições de glicose e insulina foram coletadas antes da administração da solução de glicose e 30, 60, 90 e 120 minutos após a ingestão da solução de glicose.

A concentração plasmática de glicose foi determinada pelo método da glicose oxidase. Todas as medições lipídicas foram feitas diretamente nas amostras de plasma. O colesterol total e os triglicerídeos foram avaliados por métodos enzimáticos (Roche Laboratories). O HDL-C foi quantificado pelo mesmo método e o LDL-C foi estimado pela fórmula de Friedwald. A hemoglobina glicada foi medida usando cromatografia líquida de alta eficiência (com o uso do método Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer em 2003-2004 e o método Tosoh G7 em 2007-2008, Tosoh Corp).

Para as análises hormonais, as amostras de sangue foram processadas em uma centrífuga. A progesterona foi medida pelo ensaio imunofluormétrico (Wallac, Finlândia) usando kits Auto DELFIA; androstenediona, PRL, LH e FSH, pelo ensaio imunofluormétrico; sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS), por radioimunoensaio (Cisbio International, França e DSL, Texas, EUA); e insulina e 17-OHP, por radioimunoensaio usando kits DSL. Os níveis de testosterona e SHBG foram medidos usando o imunoensaio eletroquimioluminescente (Modular, Roche). O índice de testosterona livre foi calculado com base na seguinte fórmula: testosterona total/SHBG*100. A testosterona livre foi calculada pela fórmula de Vermeulen. Todas as análises foram realizadas duas vezes e os coeficientes de variação intraensaio e interensaio não ultrapassaram 10% e 15%, respectivamente.

Biópsias endometriais As amostras endometriais serão obtidas com o cateter Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Paris, França). Parte do material foi embebido em parafina para análises histomorfométricas e imuno-histoquímicas, e o restante foi preservado em RNA para posteriores análises moleculares.

Histoquímica As amostras endometriais serão fixadas por 24 horas. em formaldeído a 10%, desidratado em concentrações crescentes de álcool etílico, clarificado em xilol e embebido em parafina. As amostras embebidas em parafina serão então cortadas em dez seções de 3 μm por sujeito. Oito dessas seções foram coradas para Fator de Crescimento Endotelial Vascular C (VEGF-C) e para imuno-histoquímica (ver abaixo), e as duas seções restantes serão coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para confirmar a fase do ciclo menstrual usando os critérios sugeridos por Noyes e cols. (1953) e morfometria (ver abaixo).

As seções serão desparafinadas convencionalmente; 0,3% H2O2 será usado para inativar a peroxidase endógena à temperatura ambiente por 10 min, seguido de lavagem com água destilada três vezes. Os cortes foram imersos em tampão citrato 0,01 M (pH 6,0) e, a seguir, levados ao forno de micro-ondas para aquecimento até o ponto de ebulição. Após 10 min, este processo será repetido duas vezes; em seguida, os cortes foram resfriados à temperatura ambiente e lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4). Uma solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 5% foi adicionada à temperatura ambiente por 20 minutos e o excesso de líquido foi descartado. Anticorpos policlonais anti-VEGF-C humano de coelho (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA) (VEGF-C: diluído a 1:100) foram adicionados à incubação a 37°C por 24 h, e os cortes foram então lavados por 5 min. três vezes. Uma solução de trabalho de IgG anti-coelho de cabra biotinilada (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA) será adicionada na diluição de 1:1000 para incubação a 37°C por 20 min. Após a lavagem, o SABC será adicionado à incubação a 37°C por 20 min, seguida de lavagem e revelação da cor via diaminobenzidina (DAB) (DAB color development kit, Dako, Dinamarca) em temperatura ambiente por 5 a 30 min., seguida por lavagem com água destilada, re-desidratação com hematoxilina por etanol graduado, transparência por xileno, selagem por goma neutra e inspeção ao microscópio de luz. O anticorpo primário foi substituído por PBS como controle negativo. Os cortes positivos que coraram satisfatoriamente no pré-experimento foram usados ​​como controles positivos.

Análises morfológicas e histomorfométricas Para quantificar os parâmetros de interesse, as imagens foram capturadas com uma câmera de alta resolução (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) adaptada a um microscópio de luz (Axiolab, Carl Zeiss) e ajustada com lentes objetivas de 40×. As imagens foram transmitidas para um computador com software AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). Para avaliação da espessura epitelial glandular e superficial, contagem de células e contagem de vasos sanguíneos recém-formados, dez imagens de cada amostra endometrial foram feitas para cada paciente. Para a determinação do VEGF-C será estabelecida a densidade numérica de vasos sanguíneos por mm2.

Análises estatísticas O tamanho amostral mínimo necessário para cada grupo será determinado a partir de um estudo piloto com 10 mulheres por grupo após estudo piloto. Assim, no cálculo do tamanho da amostra, será considerada a correlação entre as medidas do grupo. Para os resultados do número de glândulas endometriais, foi adotado um erro tipo I de 5% e um erro tipo II de 20% (amostra com poder de 0,8%) para detecção de >20% de diferença entre os grupos. Proporcional à homogeneidade, os dados quantitativos serão expressos como média ± desvio padrão. De acordo com a distribuição dos dados, será utilizado o teste t de Student ou o teste U de Mann-Whitney. O nível de significância adotado foi de 95% (α ≤ 5%). Além disso, ANOVA ou o teste de Kruskal-Wallis serão utilizados para comparações histológicas e imuno-histoquímicas, quando o grupo adicional (SOP durante a fase proliferativa) for incluído. Em seguida, de acordo com a distribuição dos dados, será aplicado o teste de Tukey ou o teste de Dunn. Quando possível, os sujeitos do Estudo A e B foram combinados para análise.