Progesteronverkan på endometrium av PCOS

PATIENTER OCH METODER

Inklusionskriterier för kvinnor med PCOS kommer att vara: a) åldrarna 18 till 35 år, och b) PCOS definierades av Rotterdamkriterierna, som inkluderar två av följande tre egenskaper: a) oligo-amenorré; b) kliniska eller biokemiska tecken på hyperandrogenism; och c) polycystiska äggstockar (6). Dessa kriterier ger fyra PCOS-fenotyper (A till D) (1-3). Kontroller rekryterades från familjeplaneringspolikliniken. Alla deltagare kommer att vara friska kvinnor i åldrarna 18 till 35 år med regelbundna menstruationscykler, inga tecken på hirsutism, inga samsjukligheter och inte använda hormonmediciner under de senaste 3 månaderna.

Uteslutningskriterier är följande: a) användning av någon hormonbehandling under de senaste 3 månaderna; b) andra orsaker till anovulering som framgår av onormala nivåer av prolaktin, kortisol, dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), 17-hydroxiprogesteron (17-OHP), androstenedion, sköldkörtelstimulerande hormon (TSH) och fritt T4, i blodprover som tagits mellan kl. dag 2 och 5 av cykeln hos cyklande försökspersoner eller någon annan dag hos patienter med amenorré; c) gynekologiska störningar eller andra associerade sjukdomar, såsom endometrios, hypertoni eller diabetes mellitus; d) follikelstimulerande hormon (FSH) >15 UI/L (cykeldagar 2-5); eller e) en positiv p-subenhet av humant koriongonadotropin (P-HCG).

Studieprotokoll

Denna studie har tidigare godkänts av forskningsetiska kommittén (#21253613.6.0000.0068) vid Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brasilien. Patienterna kommer att utvärderas på gynekologisk poliklinik. Patienterna kommer att delas in i två grupper: a) PCOS och b) kontroller. Alla ämnen kommer att vårdas vid endokrinologisk gynekologisk sektion och Human Reproductive Center på Gynecology Division, Hospital das Clínicas, FMUSP. Efter att ha undertecknat det informerade samtycket kommer att skrivas i enlighet med resolution 196/96 från National Health Board (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), alla ämnen kommer att inkluderas i studien och utvärderas enligt följande:

Förval: Detta besök inkluderar följande: intervju för medicinsk historia; övergripande fysiska och gynekologiska undersökningar; viktmätning (våg Filizola, modell PL-150, med en kapacitet för 150 kg); höjdmätning med en metallstadiometer fäst på vågen; bukomkrets (AC) mätning med ett måttband i det smalaste området mellan den sista kustbågen och höftbenskammen; höftomkrets (HC) mätt runt omkretsen av höfter på toppen av höftbenskammen och skinkorna, kroppsmassaindex (BMI) och blodtrycksmätning (BP); hirsutism enligt det modifierade Ferriman-Gallwey (mFG) poängsystemet med nio områden, där patienter med en poäng högre än 8 poäng anses hirsuta.

Menstruationscykeln anses vara normal när intervallet mellan mens var 21 till 35 dagar och blodflödet varade inte mer än 7 dagar. Cykeln karakteriserades som anovulatorisk när intervallet mellan blodflödena var >35 dagar (1). Amenorré definieras som frånvaron av menstruationsflöde under en period som motsvarar de tre föregående cyklerna eller under >90 dagar (1,20).

Blod kommer att samlas in och ett transvaginalt bäckenultraljud kommer att utföras på alla försökspersoner.

Studie A: Sex PCOS-patienter med amenorré (cykler >90 dagar) och negativt β-HCG kommer att ordineras dagligen mikroniserad P4 (400 mg) administrerad via vaginal väg under 10 dagar. Två endometriebiopsier kommer att utföras, en mellan den 5:e och 9:e dagen och den andra mellan den 21:e och 24:e dagen (under den andra behandlingscykeln med P4) i menstruationscykeln (dag 1 är den första dagen av vaginal blödning). En tredje biopsi kommer att upprepas på den 4:e cykeln av P4-behandling, mellan cykeldagarna 21 och 24 (Fig. 2). Denna del av studien kommer att utformas för att bedöma om P4 skulle kunna omvandla proliferativt till sekretoriskt endometrium, oavsett antalet behandlingscykler.

Studie B:

PCOS: Sjutton PCOS-patienter genomgick två endometriebiopsier efter den första P4-behandlade cykeln, den första mellan dag 5-9 av cykeln och den andra mellan dag 20-22 (dvs under P4-behandling) av cykeln.

Kontroller: Tretton ägglossningskontrollkvinnor under två endometriebiopsier kommer att utföras efter den första månaden av luteal P4-behandling, den första mellan dagarna 5-9 och den andra mellan dagarna 20-22 av cykeln.

Analyser Det orala glukostoleranstestet (OGTT) bestod av 75 gram glukos administrerat oralt efter tre dagar av en kolhydratrik diet; blodprover för glukos- och insulinmätningar togs före administrering av glukoslösningen och 30, 60, 90 och 120 minuter efter intag av glukoslösningen.

Plasmaglukoskoncentrationen bestämdes med glukosoxidasmetoden. Alla lipidmätningar gjordes direkt i plasmaproverna. Totalt kolesterol och triglycerider bedömdes med användning av enzymmetoder (Roche Laboratories). HDL-C kvantifierades med samma metod och LDL-C uppskattades med Friedwald-formeln. Det glykerade hemoglobinet mättes med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (med användning av Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer-metoden 2003-2004 och Tosoh G7-metoden 2007-2008, Tosoh Corp).

För hormonanalyser bearbetades blodproverna i en centrifug. Progesteron mättes med den immunofluorometriska analysen (Wallac, Finland) med användning av Auto DELFIA-kit; androstenedion, PRL, LH och FSH, genom den immunofluorometriska analysen; dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), genom radioimmunoanalys (Cisbio International, Frankrike och DSL, Texas, USA); och insulin och 17-OHP, genom radioimmunoanalys med användning av DSL-kit. Testosteron- och SHBG-nivåerna mättes med användning av elektrokemiluminescent immunoassay (Modular, Roche). Det fria testosteronindexet beräknades utifrån följande formel: totalt testosteron/SHBG*100. Fritt testosteron beräknades med Vermeulens formel. Alla analyser utfördes två gånger och variationskoefficienterna inom analys och interanalys översteg inte 10 % respektive 15 %.

Endometriebiopsier Endometrieprover kommer att tas med Pipelle de Cornier-katetern (Laboratoire CCD, Paris, Frankrike). En del av materialet var inbäddat i paraffin för histomorfometriska och immunhistokemiska analyser, och resten bevarades i RNA för senare molekylära analyser.

Histokemi Endometrieprover fixeras i 24 timmar. i 10 % formaldehyd, dehydratiserad i ökande koncentrationer av etylalkohol, rensad i xylen och sedan inbäddad i paraffin. De paraffininbäddade proverna skärs sedan i tio 3-μm sektioner per försöksperson. Åtta av dessa sektioner färgades för vaskulär endoteltillväxtfaktor C (VEGF-C) och för immunhistokemi (se nedan), och de två återstående sektionerna kommer att färgas med hematoxylin och eosin (H&E) för att bekräfta menstruationscykelfasen med de föreslagna kriterierna av Noyes et al. (1953) och morfometri (se nedan).

Sektioner kommer att avvaxas på konventionellt sätt; 0,3 % H2O2 kommer att användas för att inaktivera endogent peroxidas vid rumstemperatur i 10 minuter, följt av tvättning med destillerat vatten tre gånger. Sektionerna nedsänktes i 0,01 M citratbuffert (pH 6,0) och placerades sedan i en mikrovågsugn för uppvärmning till kokpunkten. Efter 10 minuter kommer denna process att upprepas två gånger; sedan kyldes sektionerna vid rumstemperatur och tvättades två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7,4). En 5%-ig bovint serumalbumin (BSA) blockerande lösning tillsattes vid rumstemperatur under 20 minuter och överskottsvätskan kasserades. Kanin anti-humana VEGF-C polyklonala antikroppar (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: utspädd vid 1:100) sattes till inkubationen vid 37°C under 24 timmar, och sektionerna tvättades sedan i 5 min. tre gånger. En biotinylerad get anti-kanin IgG (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) arbetslösning kommer att tillsättas vid 1:1000 spädning för inkubation vid 37°C i 20 minuter. Efter tvätt tillsätts SABC till inkubationen vid 37°C i 20 minuter, följt av tvättning och färgframkallning via diaminobenzidin (DAB) (DAB färgutvecklingskit, Dako, Dinamarca) vid rumstemperatur i 5 till 30 minuter, följt av genom tvättning med destillerat vatten, hematoxylin återfärgande uttorkning via graderad etanol, transparens via xylen, försegling via neutralt gummi och inspektion under ljusmikroskop. Den primära antikroppen ersattes med PBS som en negativ kontroll. De positiva sektionerna som färgades tillfredsställande i förexperimentet användes som positiva kontroller.

Morfologiska och histomorfometriska analyser För att kvantifiera parametrarna av intresse togs bilder med en högupplöst kamera (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) anpassad till ett ljusmikroskop (Axiolab, Carl Zeiss) och justerade med 40× objektiv. Bilderna överfördes till en dator med programvaran AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). För bedömning av körtel- och ytepiteltjocklek, cellantal och räkning av nybildade blodkärl gjordes tio bilder av varje endometrieprov för varje patient. För VEGF-C-bestämning kommer den numeriska tätheten av blodkärl per mm2 att fastställas.

Statistiska analyser Den minsta urvalsstorlek som behövs för varje grupp kommer att bestämmas från en pilotstudie med 10 kvinnor per grupp efter pilotstudie. Vid beräkning av urvalsstorleken kommer alltså korrelationen mellan gruppmätningarna att beaktas. För resultaten av antalet endometriekörtlar användes ett typ I-fel på 5 % och ett typ II-fel på 20 % (prov med 0,8 % effekt) för detektering av >20 % skillnad mellan grupperna. I proportion till homogenitet kommer de kvantitativa data att uttryckas som medelvärde ± standardavvikelse. I enlighet med datadistribution kommer Student t-testet eller Mann-Whitney U-testet att användas. Signifikansnivån sattes till 95 % (α ≤ 5 %). Dessutom kommer ANOVA eller Kruskal-Wallis-testet att användas för histologiska och immunhistokemiska jämförelser, när den ytterligare gruppen (PCOS under proliferativ fas) inkluderades. Sedan, i linje med datadistributionen, kommer antingen Tukey-testet eller Dunn-testet att tillämpas. När det var möjligt kombinerades ämnena i studie A och B för analys.