허혈성 심근병증의 유전학

B.3. 결과 및 영향:

Magdy yacoub 경이 이 프로젝트를 한 번 이상 수정한 것은 큰 영광이며 저와 그가 Magdy yaq 경의 모든 프로젝트 팀에게 큰 영광입니다. 이 프로젝트의 공동 연구자로 채택되었으며, 이는 이집트인의 건강에 관심이 있는 모든 것에 대한 그의 애국심과 관심을 진정으로 반영합니다. 심부전의 단계, 심부전의 증상이 있는 임상 단계 및 비대상성 말기 심부전. 이러한 특정 바이오마커는 심부전의 후기 중증 증상 단계로 진행될 위험이 극도로 높은 IHD 및 DCM 환자에 대한 진단 바이오마커로 크게 사용될 수 있습니다. 이러한 환자의 조기 선별 검사는 면밀한 모니터링과 치료 및 비치료 전략을 통해 심부전의 후기 단계로의 진행을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 증상이 있는 심부전 환자의 진행을 늦추거나 예방하기 위해 사용되는 전통적인 약물(주로 베타 차단제 및 안지오텐신 전환 효소 억제제)이 진행을 예방하는 효과가 입증되지 않은 모든 IHD 환자에게 이미 처방되고 있음을 고려했습니다. 환자에서 전형적인 심부전 환자(좌심실 기능 장애 환자)까지. 위의 가설에 기초하여, 구조적 심장질환 환자(B기 심부전)에서 전형적 및 말기 심부전 환자(C기 및 D기 심부전)로의 진행을 예방할 수 있는 새로운 치료법에 대한 절실한 필요성이 있다.

예상되는 결과는 무증상 구조적 심장 장애(단계 B 심부전)에서 전형적으로 증상이 있는 심부전(단계 C) 및 비대상성 심부전(단계 D)으로의 임상적 진행의 새로운 유전적 경로를 설명할 수 있습니다.

이 프로젝트의 예상 결과는 기본 IHD 또는 DCM과 함께 다양한 심부전 단계의 유전적 바이오마커에 대한 이집트 최초의 데이터베이스의 새로운 기초로 이어질 수 있습니다.

아이디어의 참신함과 가장 최근의 유전자 발현 프로파일링 기술과 가장 최신의 생물정보학 방법론을 사용하려는 우리의 계획은 이 작업의 결과를 분자 유전학 분야와 심장학 분야 모두에서 영향력 지수가 높은 저널에 게시할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

이 프로젝트의 예상 결과는 이집트 및 전 세계 심부전 및 심장 분자 유전학 분야의 많은 석사 및 박사 학위 후보자에게 참고 자료가 될 수 있습니다. 우리가 알고 있는 대부분의 경우 심부전의 여러 단계에서 특정 유전자 발현 프로파일링을 조사한 이전 연구가 없다는 점을 감안할 때 이 아이디어의 참신함은 해당 분야의 전문 과학자들로부터 높은 인용 점수를 받을 수 있습니다.

진행성 심부전 단계 발병 위험이 높은 무증상 구조적 심장질환 환자의 조기 선별검사는 약리학적 및 비약물학적 전략을 통해 진행을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이것은 심부전의 심각한 증상이 있는 비대상 단계에 있는 환자의 관리 및 치료에 사용되는 엄청난 양의 정부 자금을 절약하는 데 기여할 수 있습니다.

조사자들의 계획은 이 프로젝트에서 공개될 정보를 사용하여 가장 최근에 조사된 RNA 활성화 및 억제 기술을 적용하여 진행성 단계의 심부전 VS 환자에서 유전자 과발현 및 유전자 조절 장애를 치료하는 것입니다. 심부전의 초기 무증상 단계에 있는 사람들은 심부전의 초기 단계에서 진행성 단계로의 진행을 예방하고 말기 심부전 환자를 안정적인 무증상 정상 라이프스타일 단계로 회복하기 위한 혁신적인 새로운 유전자 치료법의 길을 열었습니다. 질병. 이 새로운 치료법은 심각한 장애를 일으키는 이 질병으로 고통받는 엄청난 수의 이집트인의 고통을 완화하는 데 기여할 뿐만 아니라 전 세계 유전자 치료 분야에서 과학적 혁명적 돌파구가 될 것입니다. 우리는 이집트인이 인내, 결단력, 싸움, 꿈에 대한 믿음으로 기적을 만들 수 있다는 믿음으로 가득 차 있습니다.

B.4. 최신 기술 및 우수성:

심부전(HF)은 약 650만 명의 성인 미국인에게 영향을 미칩니다[1]. 1979년에서 2000년 사이에 생존율이 10% 증가했지만 현재 5년 사망률은 여전히 ​​50% 정도입니다[1, 2]. 박출률이 감소된 말기 심부전(HFrEF)은 다양한 병인과 유전적 기여에도 불구하고 "최종 공통 경로"를 통해 진화한다는 오랜 패러다임이 있습니다[3, 4]. HFrEF 관리에 대한 임상 시험 결과 및 현재 지침은 주로 좌심실 박출률의 정도와 NYHA(New York Heart Association) 분류를 사용한 임상적 중증도를 기반으로 이러한 관점과 직접적인 치료를 확인합니다[5].

허혈성 심장 질환(IHD)은 WHO 보고서에 따르면 전 세계적으로 가장 흔한 사망 원인이며 선진국에서 심부전의 주요 원인입니다[6-9]. IHD에 이차적인 심부전은 비허혈성 병인에 비해 더 높은 사망률과 독립적으로 연관되는 것으로 밝혀졌습니다[10, 11]. 증가하는 발병률은 급성 심근 경색 치료에서 혈전 용해 및 일차 경피적 관상 동맥 중재술의 높은 효능으로 인해 환자 생존율이 향상되었지만 종종 좌심실 (LV) 리모델링 및 만성 좌심실로 인한 이환율 증가로 이어집니다. 기능 장애. 허혈성 심근병증(ICM)이라는 용어는 다음 중 하나 이상을 동반한 좌심실 수축 기능 장애로 정의되었습니다: 이전의 심근 재관류술 또는 심근 경색의 병력, 왼쪽 주 줄기 또는 왼쪽 전하행 동맥의 75% 이상의 협착증, 또는 두 가지 75% 이상의 협착이 있는 혈관 이상 [12].

심부전의 가장 흔한 원인 중 하나는 심근병증입니다. American Heart Association은 심근병증을 주로 유전적이고 기계적 및/또는 전기적 기능 장애와 관련된 이질적인 심근 질환 그룹으로 설명했습니다[13]. DCM은 비정상적인 부하 조건이 없는 상태에서 좌심실 또는 양심실 확장 및 수축기 기능 장애가 있는 것이 특징입니다. 박출률이 감소된 심부전의 두 번째로 흔한 원인입니다. DCM은 질병의 발병과 경과를 결정하는 다양한 유전적 변이와 환경적 요인을 가진 복합 질환이다[14, 15].

IHD와 심근병증은 심근 구조의 변형을 유도하고 좌심실 박출률(LVEF)의 감소를 포함하여 심장 기능의 변경을 유발할 수 있습니다[16]. "심부전" 단계에서 환자를 식별하면 적응된 의료 및 비의료 전략을 구현하여 HF의 발달을 예방할 수 있습니다. 이 조용한 전임상 상태(심부전 전)는 무증상 좌심실 기능 장애(ALVD)라고 하며 경흉부 심초음파로만 구별할 수 있습니다. 일반 인구에서 흔한 ALVD는 명백한 HF가 발생할 위험이 높습니다. 실제로, ALVD 피험자는 정상 좌심실 EF를 가진 개인에 비해 초심성 심부전의 연간 입원률이 12배 증가하고[17], 6년 동안 사망 위험이 4배 증가[16] . 주요 미충족 임상 과제를 나타내는 ALVD에 대한 효과적인 대규모 스크리닝에는 ALVD 바이오마커의 결정이 필요합니다.

ALVD에 대한 스크리닝은 10년 이상 시작되었습니다[17,18]. 그러나 ALVD 바이오마커는 없습니다. 실제로, ALVD 진단은 시간과 비용이 많이 들고 위험에 처한 많은 개인에게 적용할 수 없는 복잡한 심초음파 분석을 보증합니다. 심혈관 위험 인자의 일반적인 증가로 인해 ALVD가 매우 널리 퍼져 있기 때문에 바이오마커(들)의 부족이 매우 중요할 수 있습니다[19]. ALVD는 심각한 HF의 예측 조기 지표로 확립되었습니다[20]. 추적 연구에 따르면 ALVD 환자의 연평균 만성 심부전 발생률은 4.9~20%, 사망률은 5.1~10.5%인 것으로 나타났습니다[21,22]. 이러한 관찰은 최근 ALVD 대상자의 경우 31%, 수축기 HF를 앓고 있는 환자의 경우 47%의 사망률을 입증한 5년 생존율 분석에서 확인되었습니다[23]. 마지막으로, SOLVD 연구는 ALVD의 치료가 HF의 발생을 상당히 지연시킬 수 있음을 입증했습니다[24]. 따라서 명백한 HF가 발생하기 전에 일반 인구에서 ALVD 개인을 식별하는 것이 임상적으로 가장 중요할 수 있습니다.

허혈성 심장 질환(IHD) 환자(이전 급성 심근 경색 병력이 있거나 없음) 또는 정상적인 좌심실 기능(B기)을 유지한 DCM 환자, IHD 또는 DCM 환자에 대해 특이적인 유전적 바이오마커를 조사한 시험이 부족합니다. 전형적인 증상이 있는 심부전(단계 C) 및 비대상성 심부전으로 진행하는 IHD 또는 DCM 환자(단계 D). Maciejak et al,[25]은 좌심실 기능 장애 VS가 발생한 급성 심근 경색증(AMI)이 있는 IHD 환자의 유전적 바이오마커를 조사했습니다. 동일한 기간 동안 정상 심실 박출률을 유지한 급성 심근경색 환자. 그들은 HF를 개발한 AMI에서 변경된 유전자 발현 프로필을 보여주었습니다. Sweet et al, [26]은 허혈성 심근병증(ICM) 환자 및 DCM 환자 대 심혈관 질환의 병력이 없는 건강한 환자의 전체 전사체를 분석했습니다. 그들은 ICM 및 DCM을 대표하는 주요 병인 특정 서명을 발견했습니다. Tijsen 등[27]은 건강한 피험자, 심부전 환자, 심부전으로 인한 호흡곤란 환자 및 심부전 이외의 원인으로 인한 호흡곤란 환자에서 마이크로 RNA 어레이를 수행했습니다. 그들은 HF 환자에서 증가하는 6개의 miRNA를 확인했으며, 그 중 miR423-5p는 HF의 임상적 진단과 가장 밀접하게 관련되어 있습니다. Smih F et al, [28]은 마이크로어레이 분석을 통해 무증상 좌심실 기능 장애, 즉 심부전 전 환자에 대한 특정 유전자 발현 프로필을 조사했습니다. 위에서 언급한 시험 중 어느 것도 심부전 VS의 진행성 증상 단계에 특이적인 유전자 발현 프로필 또는 유전적 바이오마커 시그니처를 조사하지 않았습니다. 전임상 심부전 단계.

이전의 마이크로어레이 연구는 HF 병인[28-33] 사이에 뚜렷한 유전자 발현 시그니처를 밝혔습니다. 그러나 다른 사람들은 구별을 찾지 못했습니다 [34, 35]. 직접 RNA 시퀀싱(RNA-seq)은 또한 전사체의 정확한 정량화를 제공하며 HF와 정상(NF) 심장 사이의 발현 시그니처를 식별하는 데 사용되었습니다[36], 새로운 전사 조절자 및 ICM 또는 DCM에서 교란된 miRNA 네트워크[37 , 38], 사전 및 사후 LVAD 전 사체 [39, 40], 소아 심근 병증의 일반적인 HF 유전자 [41], DCM의 스 플라이 싱, eQTL 및 대립 유전자 발현 [42].

심부전 후기 단계로 진행하는 IHD 또는 DCM 환자 집단에서 유전자 과발현 또는 유전자 조절 장애와 같은 특정 유전적 변이에 대한 완전한 이해 VS. 정상적인 수축기 기능을 유지하는 IHD 또는 DCM 환자는 IHD 환자 및 후기 심부전으로의 진행 위험이 높은 DCM 환자의 진단적 유전적 바이오마커를 찾는 길을 열 수 있습니다. 또한 심부전의 다른 단계에서 IHD 및 DCM 피험자에서 차등 유전자 발현 프로파일을 찾는 것은 B기 IHD 환자의 심부전 진행을 예방하고 IHD 환자의 회복을 위한 새로운 유전자 요법의 혁신을 위한 첫 번째 단계일 수 있습니다. 심부전의 진행 단계(C 및 D).

B.7. 접근 방식 및 방법론:

1. 프로젝트 관리 및 컨소시엄

2. 환자 모집 및 할당 이 연구의 프로토콜은 Asyut University 교육 심장병 병원의 기관 검토 위원회에서 광범위하게 설계하고 검토할 것입니다. 모든 환자는 모집 전에 자세한 정보에 입각한 동의서에 서명해야 합니다.

   포함 기준: HF 증상이 없는 IHD 또는 DCM 환자(B기), 전형적인 HF 증상(C기) 및 비대상성 HF 환자(D기).

   제외 기준: IHD 또는 DCM 이외의 구조적 심장 질환이 있는 환자.

   본 연구에서는 Assyut University 교육 심장병 병원에서 IHD 환자 또는 DCM 환자를 모집합니다.

   모집된 모든 환자는 병원에서 최소 2명의 심장 전문의에 의해 완전한 실험실 검사와 완전한 신체 검사를 받게 됩니다. 모든 환자는 구조적 심장 질환 감지 및 확인을 위한 심초음파 검사와 심부전 병기 결정을 위한 박출률의 정확한 측정을 받게 됩니다.

   모집된 환자는 심부전의 현재 임상 단계에 따라 연구 그룹 중 하나에 할당됩니다.

   A군: 심부전의 임상 증상이 없고 좌심실 수축 기능이 정상인 IHD 환자(전임상 단계 또는 B기 심부전) B군: 박출률 < 35%와 함께 심부전의 전형적인 임상 증상이 있는 IHD 환자( C기) C군: 비대상성 심부전(D기 심부전) IHD 환자 D군: 심부전의 임상적 증상이 없고 좌심실 수축 기능이 정상인 DCM 환자(전임상기 또는 B기 심부전)군 E: 박출률 < 35% 감소와 함께 심부전의 전형적인 임상 증상이 있는 DCM 환자(C기 심부전) F군: 비대상성 심부전이 있는 DCM 환자(D기 심부전)

   외부 심장 클리닉, 내부 심장과 및 Assyut University 교육 심장 병원의 집중 심장 치료실에서 환자를 모집합니다.

   표본 크기 계산 총 CHD 유병률의 유병률은 20세 이상의 미국 성인에서 6.7%이고 DCM의 유병률에 기초하여 기술 연구 설계(43)의 표본 크기에 대한 방정식에 따라 IHD 환자의 표본 크기를 계산합니다. 100,000(44)당 5-8입니다.

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= 표본 크기 Z1-α/2= 평균에서 표준 오차의 수를 나타냄(상수 = 1.96) P= 관심 비율 값에 대한 최선의 추측 비율을 나타냅니다. = 유병률 D= 비율 또는 거리의 양쪽에 필요한 절대 정밀도; 추정치가 원하는 이자 비율에 얼마나 가까운지. 0.05.

   0.067의 유병률을 기준으로 IHD 환자에게 필요한 샘플 크기는 96명의 환자입니다.

   유병률 0.008을 기준으로 DCM 환자에게 필요한 표본 크기는 11명입니다. 총 표본 크기(대조군 포함)는 107명입니다.

3. 심장 생검

   Bioptome은 심실 조직 추출(생검)에 사용됩니다. 추출된 표본은 섭씨 -80도의 액체 질소에 보관됩니다.

4. 키트, 화학물질 및 소모품 수입
5. RNA 추출 제조사의 지침(Life Technologies Invitrogen, USA)에서 권장하는 Tempus TM Blood RNA Tube 내 Tempus TM spin RNA Isolation Kit를 사용하여 임상 심부전 단계가 다른 환자와 건강한 사람의 조직 표본에서 Total RNA를 추출합니다. (45) (부록 A)

7- RNA 시퀀싱

(Thermofisher Ion Torrent 플랫폼): 옵션 A

RiboMinus™ Eukaryote System v2(부록 C)를 사용하여 차세대 시퀀싱 분석을 위한 완전히 완전한 전사체 분리가 생성됩니다. Ion Total RNA-Seq Kit v2는 간단한 RNA 라이브러리 구축에 사용됩니다(부록 D). Ion Chef 시스템은 워크어웨이 템플릿 준비 및 칩 로딩에 사용됩니다(부록 E). Ion GeneStudio S5 시스템은 트랜스크립톰까지 유전자 패널의 시퀀싱에 활용됩니다(부록 F). Torrent Suite 소프트웨어는 내보낼 수 있는 FASTQ 또는 BAM 형식으로 시퀀스 읽기를 자동으로 제공합니다(부록 G).

8- 생물 정보학 및 데이터 분석

Torrent 제품군 소프트웨어 "RNASeqAnalysis" 플러그인은 RNA 전사 정렬 및 정량화를 포함한 초기 분석에 사용됩니다. 우리는 hg19를 인간 참조 게놈으로 사용할 것이며, 여기서 전체 및 부분 정렬은 STAR 및 Bowtie2 매퍼를 모두 사용하여 감지됩니다. Picard 도구는 각 유전자에 정렬된 읽기 수를 계산하는 데 적용되는 반면 커프스 단추 소프트웨어는 각 유전자에 대해 서로 다른 이소폼을 나타내는 데 사용됩니다. 샘플을 비교하는 플롯뿐만 아니라 개별 샘플에 대해 포괄적인 플롯이 생성됩니다. 추가적인 특정 분석은 접힘 변화 계산, 상향 및 하향 조절된 유전자/이소형 식별 및 Cytoscape 소프트웨어를 사용한 경로 강화 분석을 위해 사내에서 개발된 스크립트(Python 또는 R)를 사용하여 달성될 것입니다. 경로 농축 분석은 시계열 데이터에서 질병에 역할을 할 수 있는 경로를 식별할 수 있습니다. 통합 Multi-Omics 접근 방식을 적용하여 두 가지 유형의 데이터(RNA-Seq)에서 얻은 데이터를 통합하고 연관시킬 것입니다.

9- 원고 작성 및 출판

우리는 이 프로젝트의 출판으로 분자 유전학 분야와 심장학 분야에서 적어도 두 개의 높은 임팩트 팩터 저널이 나올 것으로 기대합니다.

나.8. 자격 및 역량(최대 2페이지):

가장 중요한 자격은 연구를 신속하게 수행할 수 있는 전문 심장학 및 분자 유전 전문가의 가용성입니다. 또한, 마이크로어레이 유전자 발현 프로파일링과 전체 전사체 이온 토렌트 RNA 시퀀싱 모두에 필요한 고가의 근본적으로 중요한 기기는 국립 연구 센터의 분자 연구실, Magdy Yaacoub 재단 및 이집트의 다른 많은 개인 분자 연구실에서 사용할 수 있습니다.

가장 중요한 능력은 키트, 화학 물질, 소모품 및 프로젝트의 완전한 컨덕턴스를 위해 구매해야 하는 일부 사소한 도구의 높은 비용입니다.