Genetica van ischemische cardiomyopathie

B.3. Uitkomsten en impact:

Het is een grote eer dat meneer Magdy Yacoub dit project meer dan eens heeft herzien en het is een grote eer voor mij en het hele projectteam dat hij meneer Magdy Yaq is. Aanvaard om de co-onderzoeker van dit project te zijn, en dit weerspiegelt werkelijk zijn patriottisme en zijn zorg voor alles wat in het belang is van de gezondheid van de Egyptenaren. stadium van hartfalen, symptomatisch klinisch stadium van hartfalen en gedecompenseerd hartfalen in het eindstadium. Deze specifieke biomarkers kunnen in grote mate worden gebruikt als diagnostische biomarkers voor IHD- en DCM-patiënten met een extreem hoog risico op progressie naar latere ernstig symptomatische stadia van hartfalen. De vroege screening van die patiënten kan helpen voorkomen dat ze zich ontwikkelen tot latere stadia van hartfalen door nauwlettend toezicht en therapeutische en niet-therapeutische strategieën. We houden er rekening mee dat de traditionele farmacologische middelen die worden gebruikt om de progressie van typisch symptomatische patiënten met hartfalen te vertragen of te voorkomen - voornamelijk bètablokkers en angiotensine-converterende enzymremmers - al worden voorgeschreven aan alle IHD-patiënten zonder bewezen werkzaamheid om de progressie van die patiënten te voorkomen. patiënten tot typische patiënten met hartfalen (patiënten met linkerventrikeldisfunctie). Op basis van de bovenstaande hypothese is er een grote behoefte aan nieuwe therapieën die de progressie van patiënten met structurele hartziekte (stadium B hartfalen) naar typische en eindstadium hartfalenpatiënten (stadium C en D hartfalen) kunnen voorkomen.

De verwachte resultaten kunnen nieuwe genetische routes verklaren van de klinische progressie van asymptomatische structurele hartaandoening (stadium B hartfalen) tot typisch symptomatisch hartfalen (stadium C) en gedecompenseerd hartfalen (stadium D).

De verwachte resultaten van dit project kunnen ons leiden naar de nieuwe oprichting van de eerste Egyptische database van de genetische biomarkers van verschillende stadia van hartfalen met onderliggende IHD of DCM.

De nieuwheid van het idee en ons plan om de meest recente genexpressieprofileringstechnieken en de meest bijgewerkte bio-informatica-methodologieën te gebruiken, kunnen de weg vrijmaken voor publicatie van de resultaten van dit werk in tijdschriften met een hoge impactfactor, zowel op het gebied van moleculaire genetica als op het gebied van cardiologie.

Het verwachte resultaat van dit project kan een referentie zijn voor veel kandidaten voor master- en doctoraatstitels op het gebied van hartfalen en cardiale moleculaire genetica in Egypte en de rest van de wereld. De nieuwheid van het idee, gezien het feit dat er - voor het grootste deel van onze kennis - geen eerdere studies zijn die de specifieke genexpressieprofilering in verschillende stadia van hartfalen hebben onderzocht, kan een hoge score van citatie opleveren door gespecialiseerde wetenschappers in het veld.

Vroegtijdige screening van asymptomatische patiënten met structurele hartziekte met een hoog risico op progressieve stadia van hartfalen kan hun progressie helpen voorkomen door middel van farmacologische en niet-farmacologische strategieën. Dit kan bijdragen aan het besparen van een enorm bedrag aan overheidsgeld dat wordt besteed aan de zorg en behandeling van patiënten in ernstig symptomatische gedecompenseerde stadia van hartfalen.

Het plan van de onderzoekers is om de informatie die in dit project zal worden onthuld verder te gebruiken om de meest recent onderzochte technieken van RNA-activering en -repressie toe te passen voor de behandeling van genoverexpressie en gendysregulatie bij patiënten die lijden aan progressieve stadia van hartfalen VS. die in primaire asymptomatische stadia van hartfalen om de weg vrij te maken voor de innovatieve nieuwe gentherapie voor het voorkomen van progressie van primaire stadia naar progressieve stadia van hartfalen en het herstel van patiënten met hartfalen in het eindstadium naar de stabiele asymptomatische normale levensstijlstadia van de ziekte. Deze nieuwe therapie zal niet alleen bijdragen aan het verlichten van de ellende van zo'n groot aantal Egyptenaren die lijden aan deze zeer invaliderende ziekte, maar het zal ook een wetenschappelijke revolutionaire doorbraak betekenen op het gebied van gentherapie over de hele wereld. We zijn vol vertrouwen dat we de Egyptenaar wonderen kunnen doen door geduld, vastberadenheid, strijd en geloof in onze droom.

B.4. State-of-the-art en uitmuntendheid:

Hartfalen (HF) treft naar schatting 6,5 miljoen volwassen Amerikanen [1]. Hoewel de overlevingskansen tussen 1979 en 2000 met 10% zijn gestegen, is de huidige vijfjaarssterfte nog steeds ongeveer 50% [1, 2]. Een al lang bestaand paradigma is dat hartfalen in het eindstadium met verminderde ejectiefractie (HFrEF) evolueert via een "uiteindelijk gemeenschappelijk pad", ondanks een grote verscheidenheid aan etiologieën en genetische bijdragen [3, 4]. Resultaten van klinische onderzoeken en huidige richtlijnen voor het beheer van HFrEF bevestigen dit standpunt en directe therapie, voornamelijk gebaseerd op de mate van linkerventrikel-ejectiefractie en klinische ernst met behulp van de New York Heart Association (NYHA)-classificatie [5].

Ischemische hartziekte (IHD) is wereldwijd de meest voorkomende doodsoorzaak volgens rapporten van de WHO en is de belangrijkste oorzaak van hartfalen in de ontwikkelde landen [6-9]. Hartfalen secundair aan IHD blijkt onafhankelijk geassocieerd te zijn met hogere sterftecijfers in vergelijking met een niet-ischemische etiologie [10, 11]. De toenemende incidentie wordt toegeschreven aan de hoge werkzaamheid van de trombolytische en primaire percutane coronaire interventie bij de behandeling van acute myocardinfarcten, wat leidt tot een verbeterde overleving van de patiënt, maar vaak leidt tot verhoogde morbiditeit als gevolg van remodellering van de linkerventrikel (LV) en chronische linkerventrikelreconstructie. disfunctie. De term ischemische cardiomyopathie (ICM) is gedefinieerd als systolische LV-disfunctie met een of meer van de volgende: een voorgeschiedenis van eerdere myocardiale revascularisatie of myocardinfarct, meer dan 75% stenose in de linker hoofdstam of linker voorste dalende slagader, of twee vaten of meer met een stenose van meer dan 75% [12].

Een van de meest voorkomende oorzaken van hartfalen is cardiomyopathie. De American Heart Association beschreef cardiomyopathieën als een heterogene groep myocardaandoeningen die overwegend genetisch zijn en geassocieerd zijn met mechanische en/of elektrische disfunctie [13]. DCM wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een linkerventrikel- of biventriculaire dilatatie en systolische disfunctie bij afwezigheid van abnormale belastingsomstandigheden. Het is de tweede meest voorkomende oorzaak van hartfalen met een verminderde ejectiefractie. DCM is een complexe aandoening met diverse genetische varianten en omgevingsfactoren die het begin en het verloop van de ziekte bepalen [14, 15].

IHD en cardiomyopathieën induceren modificatie van de myocardiumstructuur en kunnen leiden tot l veranderingen van de hartfunctie [16] inclusief een vermindering van de linkerventrikelejectiefractie (LVEF). Identificatie van patiënten in het "pre-hartfalen" stadium kan de ontwikkeling van HF voorkomen door de implementatie van aangepaste medische en niet-medische strategieën. Deze stille preklinische toestand (pre-hartfalen) wordt asymptomatische linkerventrikeldisfunctie (ALVD) genoemd en kan alleen worden onderscheiden door middel van transthoracale echocardiografie. ALVD, gebruikelijk in de algemene bevolking, leidt tot een hoog risico op het ontwikkelen van openlijk HF. ALVD-patiënten hebben inderdaad een 12-voudige toename van het jaarlijkse aantal ziekenhuisopnames voor eerste HF-gebeurtenis in vergelijking met personen met normale LVEF [17] en een 4-voudige toename van het risico op overlijden over een periode van 6 jaar [16] . Effectieve grootschalige screening op ALVD, die een grote onvervulde klinische uitdaging vertegenwoordigt, vereist een bepaling van ALVD-biomarkers.

De screening op ALVD is al meer dan een decennium begonnen [17], [18]. Er zijn echter geen ALVD-biomarkers. De ALVD-diagnose vereist immers een ingewikkelde echocardiografische analyse, die tijdrovend en kostbaar is en niet toepasbaar is op de grote populatie van personen die risico lopen. Het ontbreken van biomarker(s) kan van groot belang zijn omdat ALVD veel voorkomt vanwege de algemene toename van cardiovasculaire risicofactoren [19]. ALVD is vastgesteld als een voorspellende vroege indicator van ernstig HF [20]. Vervolgstudies hebben aangetoond dat patiënten met ALVD jaarlijks gemiddeld 4,9 tot 20% chronisch hartfalen vertonen, met een sterftecijfer van 5,1 tot 10,5% [21], [22]. Deze waarnemingen werden onlangs bevestigd in een 5-jaars overlevingsanalyse die een sterftecijfer van 31% aantoonde voor proefpersonen met ALVD en van 47% voor patiënten met systolisch HF [23]. Ten slotte toonde de SOLVD-studie aan dat de behandeling van ALVD het optreden van HF aanzienlijk kan vertragen [24]. Daarom kan het van het grootste klinische belang zijn om ALVD-individuen in de algemene populatie te identificeren voordat ze openlijk HF ontwikkelen.

Er is een gebrek aan onderzoeken die de genetische biomarkers hebben onderzocht die specifiek zijn voor patiënten met ischemische hartziekte (IHD) (met of zonder voorgeschiedenis van acuut myocardinfarct) of DCM-patiënten die een normale linkerventrikelfunctie (stadium B), IHD- of DCM-patiënten hebben behouden met typisch symptomatisch hartfalen (stadium C) en IHD- of DCM-patiënten die overgaan tot gedecompenseerd hartfalen (stadium D). Maciejak et al, [25] onderzochten de genetische biomarkers van IHD-patiënten met een acuut myocardinfarct (AMI) die VS een linkerventrikeldisfunctie ontwikkelden. patiënten met een acuut myocardinfarct die een normale ventriculaire ejectiefractie behielden gedurende dezelfde tijdsduur. Ze toonden een veranderd genexpressieprofiel aan bij AMI die HF ontwikkelde. Sweet et al, [26] analyseerden het volledige transcriptoom bij patiënten met ischemische cardiomyopathie (ICM) en DCM-patiënten versus gezonde patiënten zonder voorgeschiedenis van hart- en vaatziekten. Ze vonden belangrijke etiologiespecifieke kenmerken die typerend waren voor ICM en DCM. Tijsen et al, [27] voerden micro-RNA-array uit bij gezonde proefpersonen, patiënten met hartfalen, patiënten met kortademigheid als gevolg van hartfalen en patiënten met kortademigheid voor andere oorzaken dan hartfalen. Ze identificeerden 6 miRNA's die verhoogd zijn bij patiënten met HF, waaronder miR423-5p het sterkst gerelateerd was aan de klinische diagnose van HF. Smih F et al, [28] onderzochten, door middel van microarray-analyse, een specifiek genexpressieprofiel voor asymptomatische linkerventrikeldisfunctie, namelijk pre-hartfalenpatiënten. Geen van de bovengenoemde onderzoeken onderzocht de genexpressieprofielen of genetische biomarkerhandtekeningen die specifiek zijn voor progressieve symptomatische stadia van hartfalen VS. preklinisch stadium van hartfalen.

Eerdere microarray-onderzoeken onthulden verschillende genexpressiesignaturen tussen HF-etiologieën [28-33]; maar anderen konden geen onderscheid vinden [34, 35]. Directe RNA-sequencing (RNA-seq) biedt ook nauwkeurige kwantificering van transcripten en is gebruikt om expressiehandtekeningen tussen HF en niet-falende (NF) harten te identificeren [36], nieuwe transcriptionele regulatoren en verstoorde miRNA-netwerken in ICM of DCM [37 , 38], pre- en post-LVAD-transcriptomen [39, 40], algemene HF-genen bij pediatrische cardiomyopathie [41], en splicing, eQTL en allelische expressie in DCM [42].

Onze hypothese is dat het volledige begrip van de specifieke genetische variaties, zoals overexpressie van genen of ontregeling van genen in dergelijke cohorten van patiënten met IHD of DCM die doorgroeien naar latere stadia van hartfalen VS. IHD- of DCM-patiënten die een normale systolische functie behouden, kunnen de weg vrijmaken voor het vinden van diagnostische genetische biomarkers van IHD-patiënten en DCM-patiënten met een hoog risico op progressie naar latere stadia van hartfalen. Bovendien kan het vinden van differentiële genexpressieprofielen bij IHD- en DCM-patiënten in verschillende stadia van hartfalen de eerste stap zijn voor de innovatie van nieuwe gentherapieën ter voorkoming van progressie van hartfalen bij IHD-patiënten in stadium B en het herstel van IHD-patiënten in stadium B. progressieve stadia van hartfalen (C en D).

B.7. Aanpak en methodiek:

1. Projectmanagement en consortium

2. Werving en toewijzing van patiënten Het protocol van deze studie zal uitgebreid worden ontworpen en beoordeeld door de institutionele beoordelingsraad van het Asyut University educatieve cardiologieziekenhuis. Alle patiënten zullen worden gevraagd om een ​​gedetailleerde geïnformeerde toestemming te ondertekenen voordat ze worden aangeworven.

   Inclusiecriteria: IHD- of DCM-patiënten zonder HF-symptomen (stadium B), met typische HF-symptomen (stadium C) en patiënten met gedecompenseerde HF (stadium D).

   Uitsluitingscriteria: Patiënten met andere structurele hartziekten dan IHD of DCM.

   IHD-patiënten of DCM-patiënten die worden opgevolgd in het educatieve cardiologieziekenhuis van de Universiteit van Assyut zullen voor deze studie worden gerekruteerd.

   Alle aangeworven patiënten ondergaan volledige laboratoriumonderzoeken en volledig lichamelijk onderzoek door ten minste twee cardiologen in het ziekenhuis. Alle patiënten ondergaan echocardiografisch onderzoek voor detectie en bevestiging van structurele hartziekten en nauwkeurige meting van de ejectiefractie voor stadiëring van hartfalen.

   Gerekruteerde patiënten zullen worden toegewezen aan een van de onderzoeksgroepen op basis van het huidige klinische stadium van hartfalen.

   Groep A: IHD-patiënten zonder klinische symptomen van hartfalen en normale systolische linkerventrikelfunctie (preklinisch stadium of stadium B hartfalen) Groep B: IHD-patiënten met typische klinische symptomen van hartfalen samen met een verminderde ejectiefractie < 35% ( stadium C hartfalen) Groep C: IHD-patiënten met gedecompenseerd hartfalen (stadium D hartfalen) Groep D: DCM-patiënten zonder klinische symptomen van hartfalen en normale systolische linkerventrikelfunctie (preklinisch stadium of stadium B hartfalen) Groep E: DCM-patiënten met typische klinische symptomen van hartfalen samen met een verminderde ejectiefractie < 35% (stadium C hartfalen) Groep F: DCM-patiënten met gedecompenseerd hartfalen (stadium D hartfalen)

   Patiënten zullen worden gerekruteerd uit de externe cardiologieklinieken, de interne cardiologieafdeling en de intensive cardiale zorgafdeling van het Assyut University die cardiologieziekenhuis onderwijst.

   Berekening van de steekproefomvang We berekenen de steekproefomvang van IHD-patiënten volgens de vergelijking voor de steekproefomvang van beschrijvend onderzoeksontwerp (43) op basis van de prevalentie van de totale CHD-prevalentie is 6,7% bij Amerikaanse volwassenen ≥ 20 jaar en de prevalentie van DCM is 5-8 per 100000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Steekproefomvang Z1-α/2= Vertegenwoordigt het aantal standaardfouten van het gemiddelde (constante = 1,96) P= Vertegenwoordigt het aandeel van de beste gok over de waarde van het aandeel van belang. = prevalentie D= de absolute precisie vereist aan weerszijden van de proportie of de afstand; hoe dicht bij het belang van de schatting moet zijn. 0,05.

   De vereiste steekproefgrootte voor IHD-patiënten op basis van de prevalentie van 0,067 zal 96 patiënten zijn.

   De vereiste steekproefomvang voor DCM-patiënten op basis van de prevalentie van 0,008 zal 11 patiënten zijn. De totale steekproefomvang (inclusief controlepersonen) is 107 patiënten.

3. Cardiale biopsie

   Bioptome zal worden gebruikt voor ventriculaire weefselextractie (biopsie). De geëxtraheerde exemplaren worden bewaard in vloeibare stikstof bij - 80 graden Celsius.

4. Invoer van kits, chemicaliën en verbruiksartikelen
5. RNA-extractie Totaal RNA zal worden geëxtraheerd uit weefselspecimens van patiënten met verschillende stadia van klinisch hartfalen en gezonde mensen met behulp van Tempus TM spin RNA Isolation Kit in Tempus TM Blood RNA Tube aanbevolen door de instructies van de fabrikant (Life Technologies Invitrogen, VS). (45) (Bijlage A)

7- RNA-sequencing

(Thermofisher Ion Torrent-platform): optie A

Echt volledige transcriptoomisolatie voor sequencing-analyse van de volgende generatie zal worden geproduceerd met behulp van The RiboMinus™ Eukaryote System v2 (bijlage C). De Ion Total RNA-Seq Kit v2 wordt gebruikt voor eenvoudige constructie van RNA-bibliotheken (bijlage D). Het Ion Chef-systeem zal worden gebruikt voor de voorbereiding van een wegwerpsjabloon en het laden van chips (bijlage E). De Ion GeneStudio S5-systemen zullen worden gebruikt voor het bepalen van de sequentie van genenpanels tot aan het transcriptoom (bijlage F). Torrent Suite-software levert automatisch de sequentielezingen in exporteerbare FASTQ- of BAM-indelingen (bijlage G).

8- Bio-informatica en data-analyse

De Torrent Suite-software "RNASeqAnalysis"-plug-in zal worden gebruikt voor de initiële analyse, inclusief uitlijning en kwantificering van RNA-transcripten. We zullen hg19 gebruiken als een menselijk referentiegenoom, waar volledige en gedeeltelijke uitlijningen zullen worden gedetecteerd met behulp van zowel STAR- als Bowtie2-mappers. Picard-tools zullen worden toegepast om reads te tellen die zijn afgestemd op elk gen, terwijl manchetknopen-software zal worden gebruikt om verschillende isovormen voor elk gen weer te geven. Er worden uitgebreide plots gegenereerd voor individuele monsters, evenals plots die monsters vergelijken. De verdere specifieke analyse zal worden uitgevoerd met behulp van in-house ontwikkelde scripts (in python of R) voor berekening van vouwveranderingen, identificatie van omhoog en omlaag gereguleerde genen/isovormen en analyse van padverrijking met behulp van Cytoscape-software. Pathway-verrijkingsanalyse kan pathways identificeren die mogelijk een rol spelen bij de ziekte op basis van tijdreeksgegevens. We zullen een integratieve Multi-Omics-benadering toepassen om gegevens die we uit beide soorten gegevens hebben verkregen (RNA-Seq) te integreren en te correleren.

9- manuscript schrijven en publiceren

We verwachten dat de publicatie van dit project resulteert in ten minste twee tijdschriften met een hoge impactfactor op het gebied van moleculaire genetica en cardiologie.

B.8. Kwalificaties en competenties (max 2 pagina's):

De belangrijkste kwalificatie is de beschikbaarheid van professionele cardiologie- en moleculair genetische experts die het onderzoek snel kunnen uitvoeren. Ook zijn zeer dure fundamenteel kritische instrumenten die nodig zijn voor zowel microarray-genexpressieprofilering als hele transcriptome ion torrent-RNA-sequencing beschikbaar in de moleculaire laboratoria van het nationale onderzoekscentrum, de Magdy Yaacoub-stichting en vele andere particuliere moleculaire laboratoria in Egypte.

De belangrijkste competenties zijn de hoge kosten van de kits, chemicaliën, verbruiksartikelen en enkele kleine instrumenten die moeten worden aangeschaft voor de volledige uitvoering van het project.