Genetika ischemické kardiomyopatie

B.3. Výsledky a dopad:

Je mi velkou ctí, že sir Magdy yacoub revidoval tento projekt více než jednou, a je to velká čest pro mě a celý tým projektu, že je sir Magdy yaq. Přijat jako spoluřešitel tohoto projektu, a to skutečně odráží jeho patriotismus a jeho zájem o vše, co je v zájmu zdraví Egypťanů Zjištění genetických biomarkerů a signatur, které jsou typické pro pacienty s ischemickou kardiomyopatií a pacienty s dilatační kardiomyopatií v preklinické ambulanci stadium srdečního selhání, symptomatické klinické stadium srdečního selhání a dekompenzované konečné stadium srdečního selhání. Tyto specifické biomarkery mohou být široce používány jako diagnostické biomarkery pro pacienty s IHD a DCM s extrémně vysokým rizikem progrese do pozdějších závažných symptomatických stádií srdečního selhání. Včasný screening těchto pacientů může pomoci zabránit jejich progresi do pozdějších fází srdečního selhání pečlivým sledováním a terapeutickými i neterapeutickými strategiemi. Bereme v úvahu, že tradiční farmakologická činidla používaná ke zpomalení nebo prevenci progrese typicky symptomatických pacientů se srdečním selháním – především betablokátory a inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu – jsou již předepisována všem pacientům s IHD, u nichž není prokázána účinnost k prevenci progrese těchto onemocnění. pacientů na typické pacienty se srdečním selháním (pacienti s dysfunkcí levé komory). Na základě výše uvedené hypotézy existuje velká potřeba nových terapií, které mohou zabránit progresi pacientů se strukturálním onemocněním srdce (stadium B srdečního selhání) do typických a konečných pacientů se srdečním selháním (stadium C a D srdeční selhání).

Očekávané výsledky mohou vysvětlit nové genetické cesty klinické progrese asymptomatické strukturální srdeční poruchy (stadium B srdečního selhání) k typickému symptomatickému srdečnímu selhání (stadium C) a dekompenzovanému srdečnímu selhání (stadium D).

Očekávané výsledky tohoto projektu nás mohou vést k novému základu první egyptské databáze genetických biomarkerů různých stádií srdečního selhání se základní IHD nebo DCM.

Novost myšlenky a náš plán použít nejnovější techniky profilování genové exprese a nejmodernější bioinformatické metodologie mohou připravit cestu pro publikování výsledků této práce v časopise s vysokým impakt faktorem jak v oblasti molekulární genetiky, tak v oblasti kardiologie.

Očekávaný výsledek tohoto projektu může být referencí pro mnoho kandidátů magisterského a doktorského studia v oboru srdečního selhání a srdeční molekulární genetiky v Egyptě a po celém světě. Novost myšlenky, vzhledem k tomu, že – pro většinu našich znalostí – neexistují žádné předchozí studie, které by zkoumaly profilování specifické genové exprese v různých fázích srdečního selhání, může přilákat vysoké skóre citací ze strany specializovaných vědců v oboru.

Včasný screening pacientů s asymptomatickým strukturálním onemocněním srdce s vysokým rizikem rozvoje stadií progresivního srdečního selhání může pomoci zabránit jejich progresi farmakologickými i nefarmakologickými strategiemi. To může přispět k úspoře obrovského množství vládních peněz vynaložených na péči a léčbu pacientů v těžce symptomatických dekompenzovaných stadiích srdečního selhání.

Plánem řešitelů je dále využít informace, které budou odhaleny v tomto projektu, k aplikaci nejnovějších zkoumaných technik aktivace a represe RNA k léčbě s genovou overexpresí a genovou dysregulací u pacientů trpících progresivními stadii srdečního selhání VS. pacientů v primárních asymptomatických stádiích srdečního selhání, aby se připravila cesta pro inovativní novou genovou terapii pro prevenci progrese z primárních stádií do progresivních stádií srdečního selhání a pro zotavení pacientů v konečné fázi srdečního selhání do stabilních asymptomatických fází normálního životního stylu choroba. Tato nová terapie přispěje nejen ke zmírnění bídy tak obrovského počtu Egypťanů trpících touto velmi invalidizující nemocí, ale bude také vědeckým revolučním průlomem v oblasti genové terapie po celém světě. Jsme plni víry, že jsme Egypťané, kteří mohou dělat zázraky trpělivostí, odhodláním, bojem a vírou ve svůj sen.

B.4. Nejmodernější a dokonalost:

Srdeční selhání (HF) postihuje odhadem 6,5 milionu dospělých Američanů [1]. Přestože se míra přežití mezi lety 1979 a 2000 zvýšila o 10 %, současná pětiletá mortalita je stále kolem 50 % [1, 2]. Dlouhodobým paradigmatem je, že srdeční selhání v konečném stadiu se sníženou ejekční frakcí (HFrEF) se vyvíjí prostřednictvím „konečné společné cesty“, přestože má širokou škálu etiologií a genetických přispění [3, 4]. Výsledky klinických studií a současné doporučené postupy pro léčbu HFrEF potvrzují tento názor a přímou léčbu založenou především na stupni ejekční frakce levé komory a klinické závažnosti pomocí klasifikace New York Heart Association (NYHA) [5].

Ischemická choroba srdeční (ICHS) je podle zpráv WHO celosvětově nejčastější příčinou úmrtí a ve vyspělých zemích je hlavní příčinou srdečního selhání [6-9]. Bylo zjištěno, že srdeční selhání sekundární k ICHS je nezávisle spojeno s vyšší mortalitou ve srovnání s neischemickou etiologií [10, 11]. Zvyšující se incidence je připisována vysoké účinnosti trombolytické a primární perkutánní koronární intervence v léčbě akutních infarktů myokardu, což vede ke zlepšení přežití pacientů, často však vede ke zvýšené morbiditě v důsledku remodelace levé komory (LK) a chronické levé komory dysfunkce. Termín ischemická kardiomyopatie (ICM) byl definován jako systolická dysfunkce LK s jedním nebo více z následujících: předchozí revaskularizace myokardu nebo infarkt myokardu v anamnéze, více než 75% stenóza v levém hlavním kmeni nebo levé přední sestupné tepně nebo dvě cévy nebo více s více než 75% stenózou [12].

Jednou z nejčastějších příčin srdečního selhání jsou kardiomyopatie. American Heart Association popsala kardiomyopatie jako heterogenní skupinu onemocnění myokardu, která jsou převážně genetická a spojená s mechanickou a/nebo elektrickou dysfunkcí [13]. DCM je charakterizována přítomností levé komory nebo biventrikulární dilatace a systolické dysfunkce v nepřítomnosti abnormálních podmínek zatížení. Je druhou nejčastější příčinou srdečního selhání se sníženou ejekční frakcí. DCM je komplexní porucha s různými genetickými variantami a faktory prostředí, které určují nástup onemocnění a průběh onemocnění [14, 15].

IHD a kardiomyopatie indukují modifikaci struktury myokardu a mohou vést k l alteracím srdeční funkce [16] včetně snížení ejekční frakce levé komory (LVEF). Identifikace pacientů ve fázi „před srdečním selháním“ může zabránit rozvoji srdečního selhání prostřednictvím implementace přizpůsobených lékařských a nelékařských strategií. Tento tichý preklinický stav (před srdeční selhání) se označuje jako asymptomatická dysfunkce levé komory (ALVD) a lze jej rozlišit pouze transtorakální echokardiografií. ALVD, běžná v běžné populaci, vede k vysokému riziku rozvoje zjevného srdečního selhání. Ve skutečnosti mají pacienti s ALVD 12násobný nárůst roční míry hospitalizace pro první příhodu srdečního selhání ve srovnání s jedinci s normální LVEF [17] a 4násobné zvýšení rizika úmrtí během 6letého období [16]. . Efektivní screening ALVD ve velkém měřítku, který představuje hlavní neřešený klinický problém, vyžaduje stanovení biomarkerů ALVD.

Screening ALVD začal již více než deset let [17], [18]. Neexistují však žádné biomarkery ALVD. Diagnóza ALVD skutečně vyžaduje komplikovanou echokardiografickou analýzu, která je časově náročná, nákladná a není použitelná pro velkou populaci ohrožených jedinců. Absence biomarkeru (biomarkerů) může být velmi důležitá, protože ALVD je vysoce převládající v důsledku obecného nárůstu kardiovaskulárních rizikových faktorů [19]. ALVD byla stanovena jako prediktivní časný indikátor těžkého srdečního selhání [20]. Následné studie ukázaly, že pacienti s ALVD vykazují průměrnou roční míru chronického srdečního selhání 4,9 až 20 %, s úmrtností 5,1 až 10,5 % [21], [22]. Tato pozorování byla nedávno potvrzena v analýze míry přežití po 5 letech, která prokázala úmrtnost 31 % u jedinců s ALVD a 47 % u pacientů trpících systolickým srdečním selháním [23]. Konečně studie SOLVD prokázala, že léčba ALVD může významně oddálit výskyt srdečního selhání [24]. Proto může být nanejvýš klinicky důležité identifikovat jedince ALVD v obecné populaci dříve, než se u nich rozvine zjevné srdeční selhání.

Existuje nedostatek studií, které zkoumaly genetické biomarkery specifické pro pacienty s ischemickou chorobou srdeční (ICHS) (s nebo bez předchozí anamnézy akutního infarktu myokardu) nebo pacienty s DCM, kteří měli normální funkci levé komory (stadium B), pacienty s IHD nebo DCM s typickým symptomatickým srdečním selháním (stadium C) a pacienty s IHD nebo DCM, kteří progredují do dekompenzovaného srdečního selhání (stadium D). Maciejak et al [25] zkoumali genetické biomarkery pacientů s IHD s akutním infarktem myokardu (AMI), u kterých se rozvinula dysfunkce levé komory VS. pacienti s akutním infarktem myokardu, kteří si ve stejnou dobu zachovali normální komorovou ejekční frakci. Prokázali změněný profil genové exprese u AIM, u kterého se vyvinulo HF. Sweet et al [26] analyzovali celý transkriptom u pacientů s ischemickou kardiomyopatií (ICM) a pacientů s DCM oproti zdravým pacientům bez anamnézy kardiovaskulárních onemocnění. Našli klíčové etiologicky specifické signatury, které charakterizovaly ICM a DCM. Tijsen et al [27] provedli mikro RNA čip u zdravých subjektů, pacientů se srdečním selháním, pacientů s dušností v důsledku srdečního selhání a pacientů s dušností z jiných příčin než se srdečním selháním. Identifikovali 6 miRNA, které jsou zvýšené u pacientů se srdečním selháním, z nichž miR423-5p nejvíce souvisel s klinickou diagnózou srdečního selhání. Smih F et al [28] zkoumali pomocí mikročipové analýzy profil specifické genové exprese pro asymptomatickou dysfunkci levé komory, konkrétně u pacientů před srdečním selháním. Žádná z výše uvedených studií nezkoumala profily genové exprese nebo signatury genetických biomarkerů specifické pro progresivní symptomatická stadia srdečního selhání VS. preklinické stadium srdečního selhání.

Předchozí studie mikročipů odhalily odlišné signatury genové exprese mezi etiologiemi HF [28–33]; ale jiní nedokázali najít rozdíly [34, 35]. Přímé sekvenování RNA (RNA-seq) také poskytuje přesnou kvantifikaci transkriptů a bylo použito k identifikaci signatur exprese mezi HF a neselhávajícími (NF) srdci [36], novými regulátory transkripce a narušenými miRNA sítěmi v ICM nebo DCM [37 , 38], pre- a post-LVAD transkriptomy [39, 40], běžné HF geny u dětské kardiomyopatie [41] a sestřih, eQTL a alelická exprese v DCM [42].

Předpokládáme, že plné pochopení specifických genetických variací, jako je nadměrná exprese genů nebo genová dysregulace, u takových kohort pacientů s IHD nebo DCM, kteří progredují do pozdějších fází srdečního selhání VS. Pacienti s ICHS nebo DCM, kteří si zachovají normální systolickou funkci, mohou připravit cestu ke zjištění diagnostických genetických biomarkerů pacientů s ICHS a pacientů s DCM s vysokým rizikem progrese do pozdějších fází srdečního selhání. Navíc zjištění rozdílných profilů genové exprese u pacientů s ICHS a DCM v různých fázích srdečního selhání může být prvním krokem k inovaci nových genových terapií pro prevenci progrese srdečního selhání u pacientů s ICHS ve stadiu B a zotavení pacientů s ICHS v progresivní stadia srdečního selhání (C a D).

B.7. Přístup a metodika:

1. Projektový management a konsorcium

2. Nábor a přidělování pacientů Protokol této studie bude rozsáhle navržen a přezkoumán institucionálním kontrolním výborem vzdělávací kardiologické nemocnice Univerzity Asyut. Všichni pacienti budou před náborem požádáni, aby podepsali podrobný informovaný souhlas.

   Kritéria pro zařazení: pacienti s ICHS nebo DCM bez příznaků SS (stadium B), s typickými příznaky SS (stadium C) a pacienti s dekompenzovaným SS (stadium D).

   Kritéria vyloučení: Pacienti se strukturálními srdečními chorobami jinými než IHD nebo DCM.

   Do této studie budou zařazeni pacienti s IHD nebo pacienti s DCM sledovaní ve vzdělávací kardiologické nemocnici Assyut University.

   Všichni přijatí pacienti podstoupí kompletní laboratorní vyšetření a kompletní fyzikální vyšetření nejméně dvěma kardiology v nemocnici. Všichni pacienti podstoupí echokardiografické vyšetření pro detekci a potvrzení strukturálního srdečního onemocnění a přesné měření ejekční frakce pro staging srdečního selhání.

   Rekrutovaní pacienti budou zařazeni do jedné ze studijních skupin podle aktuálního klinického stadia srdečního selhání.

   Skupina A: pacienti s ICHS bez klinických příznaků srdečního selhání a normální systolickou funkcí levé komory (předklinické stadium nebo stadium B srdečního selhání) Skupina B: pacienti s ICHS s typickými klinickými příznaky srdečního selhání spolu se sníženou ejekční frakcí < 35 % ( stadium C srdeční selhání) Skupina C: pacienti s ICHS s dekompenzovaným srdečním selháním ( srdeční selhání stadia D) Skupina D: pacienti s DCM bez klinických příznaků srdečního selhání a normální systolické funkce levé komory (předklinické stadium nebo stadium B srdečního selhání) Skupina E: Pacienti s DCM s typickými klinickými příznaky srdečního selhání spolu se sníženou ejekční frakcí < 35 % (stadium C srdečního selhání) Skupina F: pacienti s DCM s dekompenzovaným srdečním selháním ( srdeční selhání stadia D)

   Pacienti se budou rekrutovat z externích kardiologických klinik, interního kardiologického oddělení a jednotky intenzivní kardiologické péče Fakultní kardiologické nemocnice Assyut University.

   Výpočet velikosti vzorku Velikost vzorku pacientů s IHD vypočítáme podle rovnice pro velikost vzorku deskriptivního designu studie (43) na základě prevalence celkové prevalence ICHS je 6,7 % u dospělých v USA ve věku ≥ 20 let a prevalence DCM je 5-8 na 100 000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Velikost vzorku Z1-α/2= Představuje počet standardních chyb od průměru (konstanta = 1,96) P= Představuje podíl nejlepšího odhadu o hodnotě podílu úroku. = prevalence D = absolutní přesnost požadovaná na obou stranách proporce nebo vzdálenosti; jak blízko k podílu úroku má být odhad. 0,05.

   Velikost vzorku požadovaná pro pacienty s IHD na základě míry prevalence 0,067 bude 96 pacientů.

   Velikost vzorku požadovaná pro pacienty s DCM na základě míry prevalence 0,008 bude 11 pacientů Celková velikost vzorku (včetně kontrolních subjektů) je 107 pacientů.

3. Srdeční biopsie

   Bioptom bude použit pro extrakci komorové tkáně (biopsii). Vytěžené vzorky budou uchovávány v kapalném dusíku při teplotě -80 stupňů Celsia.

4. Dovoz sad, chemikálií a spotřebního materiálu
5. Extrakce RNA Celková RNA bude extrahována ze vzorků tkáně pacientů s různými stádii klinického srdečního selhání a zdravých lidí pomocí sady Tempus TM spin RNA Isolation Kit ve zkumavce Tempus TM Blood RNA, doporučené podle pokynů výrobce (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (Příloha A)

7- Sekvenování RNA

(platforma Thermofisher Ion Torrent): možnost A

Skutečně kompletní izolace transkriptomu pro sekvenační analýzu nové generace bude vytvořena pomocí The RiboMinus™ Eukaryote System v2 (příloha C). Ion Total RNA-Seq Kit v2 bude použit pro jednoduchou konstrukci RNA knihovny (příloha D). Systém Ion Chef System se bude používat pro přípravu šablony a vkládání čipů (příloha E). Systémy Ion GeneStudio S5 budou využity pro sekvenování genových panelů až po transkriptom (příloha F). Software Torrent Suite automaticky poskytuje čtení sekvencí v exportovatelných formátech FASTQ nebo BAM (příloha G).

8- Bioinformatika a analýza dat

Plugin softwaru Torrent Suite "RNASeqAnalysis" bude použit pro počáteční analýzu včetně zarovnání a kvantifikace transkriptů RNA. Použijeme hg19 jako lidský referenční genom, kde budou detekovány úplné a částečné zarovnání pomocí mapovačů STAR i Bowtie2. Nástroje Picard budou použity k počítání hodnot přiřazených ke každému genu, zatímco software manžetových knoflíčků bude použit k reprezentaci různých izoforem pro každý gen. Pro jednotlivé vzorky budou vygenerovány ucelené grafy a také grafy porovnávající vzorky . Další specifická analýza bude dosažena pomocí in-house vyvinutých skriptů (v pythonu nebo R) pro výpočet násobné změny, identifikaci up a down-regulovaných genů/izoforem a analýzu obohacení dráhy pomocí softwaru Cytoscape. Analýza obohacení dráhy může identifikovat dráhy, které mohou mít roli v onemocnění na datech časové řady. Použijeme integrační přístup Multi-Omics k integraci a korelaci dat, která jsme získali z obou typů dat (RNA-Seq).

9- psaní a vydávání rukopisů

Očekáváme, že výsledky tohoto projektu budou publikovány alespoň ve dvou časopisech s vysokým impakt faktorem v oblasti molekulární genetiky a kardiologie.

B.8. Kvalifikace a kompetence (max 2 strany):

Nejdůležitější kvalifikací je dostupnost profesionálních kardiologických a molekulárně genetických odborníků, kteří budou schopni rychle provést studii. V molekulárních laboratořích národního výzkumného centra, nadace Magdy Yaacoub a mnoha dalších soukromých molekulárních laboratoří v Egyptě jsou také k dispozici velmi drahé fundamentálně kritické nástroje potřebné pro profilování genové exprese microarray a sekvenování RNA s iontovým torrentem celého transkriptomu.

Nejdůležitějšími kompetencemi jsou vysoké náklady na soupravy, chemikálie, spotřební materiál a některé drobné nástroje, které by měly být zakoupeny pro kompletní vedení projektu.