Genetik af iskæmisk kardiomyopati

B.3. Resultater og effekt:

Det er en stor ære, at sir Magdy yacoub reviderede dette projekt mere end én gang, og det er en stor ære for mig og hele projektets team, at han sir Magdy yaq. Accepteret som medforsker i dette projekt, Og dette afspejler virkelig hans patriotisme og hans bekymring for alt, hvad der er i egypternes helbreds interesse. stadium af hjertesvigt, symptomatisk klinisk stadium af hjertesvigt og dekompenseret hjertesvigt i slutstadiet. Disse specifikke biomarkører kan i høj grad bruges som diagnostiske biomarkører for IHD- og DCM-patienter med ekstrem høj risiko for progression til senere alvorlige symptomatiske stadier af hjertesvigt. Den tidlige screening af disse patienter kan hjælpe med at forhindre deres progression til senere stadier af hjertesvigt ved tæt overvågning og terapeutiske og ikke-terapeutiske strategier. Vi har taget i betragtning, at de traditionelle farmakologiske midler, der bruges til at bremse eller forhindre progressionen af ​​typisk symptomatisk hjertesvigt-patienter - hovedsageligt betablokkere og angiotensinkonverterende enzymhæmmere - allerede er ordineret til alle IHD-patienter uden dokumenteret effekt for at forhindre progression af disse. patienter til typiske hjertesvigtpatienter (patienter med venstre ventrikel dysfunktion). Baseret på ovenstående hypotese er der et stort behov for nye terapier, der kan forhindre progression af strukturelle hjertesygdomspatienter (stadie B hjertesvigt) til typiske og slutstadie hjertesvigt patienter (stadie C og D hjertesvigt).

De forventede resultater kan forklare nye genetiske veje for den kliniske progression af asymptomatisk strukturel hjertesygdom (stadie B hjertesvigt) til typisk symptomatisk hjertesvigt (stadie C) og dekompenseret hjertesvigt (stadie D).

De forventede resultater af dette projekt kan føre os til det nye grundlag for den første egyptiske database over de genetiske biomarkører for forskellige hjertesvigtstadier med underliggende IHD eller DCM.

Nyheden af ​​ideen og vores plan om at bruge de nyeste genekspressionsprofileringsteknikker og de mest opdaterede bioinformatikmetoder kan bane vejen for offentliggørelse af resultaterne af dette arbejde i tidsskriftet med høj effektfaktor både inden for molekylærgenetik og kardiologi.

Det forventede resultat af dette projekt kan være en reference for mange kandidater til mastergrader og doktorgrader inden for hjertesvigt og hjertemolekylær genetik i Egypten og rundt om i verden. Ideens nyhed, da der - for det meste af vores viden - ikke er nogen tidligere undersøgelser, der undersøgte den specifikke genekspressionsprofilering i forskellige stadier af hjertesvigt, kan tiltrække høje citater fra specialiserede videnskabsmænd på området.

Tidlig screening af asymptomatiske strukturelle hjertesygdomspatienter med høj risiko for udvikling af progressive hjertesvigtstadier kan hjælpe med at forhindre deres progression ved farmakologiske og ikke-farmakologiske strategier. Dette kan bidrage til at spare en enorm mængde offentlige penge brugt på pleje og behandling af de patienter i alvorligt symptomatisk dekompenserede stadier af hjertesvigt.

Planen for efterforskerne er yderligere at bruge informationen, der vil blive afsløret i dette projekt, til at anvende de senest undersøgte teknikker til RNA-aktivering og -undertrykkelse til at behandle med genoverekspression og gendysregulering hos patienter, der lider af progressive stadier af hjertesvigt VS. dem i primære asymptomatiske stadier af hjertesvigt for at bane vejen for den innovative nye genterapi til forebyggelse af progression fra primære stadier til progressive stadier af hjertesvigt og genopretning af hjertesvigtpatienter i slutstadiet til de stabile asymptomatiske normale livsstilsstadier i sygdom. Denne nye terapi vil ikke kun bidrage til at mildne elendigheden for et så stort antal egyptere, der lider af denne stærkt invaliderende sygdom, men den vil også være et videnskabeligt revolutionært gennembrud inden for genterapi over hele verden. Vi er fulde af tro på, at vi er den egyptiske, der kan lave mirakler ved tålmodighed, beslutsomhed, kamp og tro på vores drøm.

B.4. State-of-the-art og fremragende:

Hjertesvigt (HF) påvirker anslået 6,5 millioner voksne amerikanere [1]. Selvom overlevelsesraten er steget med 10 % mellem 1979 og 2000, er den nuværende 5-årige dødelighed stadig omkring 50 % [1, 2]. Et langvarigt paradigme er, at hjertesvigt i slutstadiet med reduceret ejektionsfraktion (HFrEF) udvikler sig via en "endelig fælles vej" på trods af at de har en bred vifte af ætiologier og genetiske bidrag [3, 4]. Resultater fra kliniske forsøg og aktuelle retningslinjer for håndtering af HFrEF bekræfter dette synspunkt og direkte terapi baseret hovedsageligt på graden af ​​venstre ventrikulær ejektionsfraktion og klinisk sværhedsgrad ved brug af New York Heart Association (NYHA) klassifikationen [5].

Iskæmisk hjertesygdom (IHD) er den mest almindelige dødsårsag globalt ifølge WHO-rapporter og er den førende årsag til hjertesvigt i de udviklede lande [6-9]. Hjertesvigt sekundært til IHD har vist sig at være uafhængigt forbundet med højere dødelighed sammenlignet med en ikke-iskæmisk ætiologi [10, 11]. Den stigende forekomst er blevet tilskrevet den høje effektivitet af den trombolytiske og primære perkutane koronarintervention i behandlingen af ​​akutte myokardieinfarkter, hvilket fører til forbedret patientoverlevelse, men som ofte fører til øget sygelighed på grund af venstre ventrikel (LV) remodellering og kronisk venstre ventrikel. dysfunktion. Udtrykket iskæmisk kardiomyopati (ICM) er blevet defineret som LV systolisk dysfunktion med en eller flere af følgende: en anamnese med tidligere myokardie revaskularisering eller myokardieinfarkt, mere end 75 % stenose i venstre hovedstamme eller venstre anterior nedadgående arterie, eller to kar eller mere med mere end 75 % stenose [12].

En af de mest almindelige årsager til hjertesvigt er kardiomyopatier. American Heart Association beskrev kardiomyopatier som en heterogen gruppe af myokardiesygdomme, der overvejende er genetiske og forbundet med mekanisk og/eller elektrisk dysfunktion [13]. DCM er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​venstre ventrikulær eller biventrikulær dilatation og systolisk dysfunktion i fravær af unormale belastningsforhold. Det er den næsthyppigste årsag til hjertesvigt med reduceret ejektionsfraktion. DCM er en kompleks lidelse med forskellige genetiske varianter og miljøfaktorer, der bestemmer sygdomsdebut og sygdomsforløb [14, 15].

IHD og kardiomyopatier inducerer modifikation af myokardiets struktur og kan føre til ændringer i hjertefunktionen [16] inklusive en reduktion i venstre ventrikulære ejektionsfraktion (LVEF). Identifikation af patienter på "præ-hjertesvigt"-stadiet kan forhindre udviklingen af ​​HF gennem implementering af tilpassede medicinske og ikke-medicinske strategier. Denne stille prækliniske tilstand (præ-hjertesvigt) omtales som asymptomatisk venstre ventrikulær dysfunktion (ALVD) og kan kun skelnes ved transthorax ekkokardiografi. ALVD, almindelig i den almindelige befolkning, fører til en høj risiko for at udvikle åbenlys HF. Faktisk har ALVD-personer en 12-fold stigning i den årlige indlæggelsesrate for første-hændelse HF sammenlignet med personer med normal LVEF [17] og en 4-dobling i risikoen for død over en 6-årig periode [16] . Effektiv storskala screening for ALVD, der repræsenterer en stor uopfyldt klinisk udfordring, kræver en bestemmelse af ALVD-biomarkører.

Screeningen for ALVD er startet i over et årti [17], [18]. Der er dog ingen ALVD-biomarkører. ALVD-diagnose berettiger faktisk en kompliceret ekkokardiografisk analyse, som er tidskrævende, dyr og ikke anvendelig for den store population af individer i risikozonen. Manglen på biomarkør(er) kan være af stor betydning, fordi ALVD er meget udbredt på grund af den generelle stigning i kardiovaskulære risikofaktorer [19]. ALVD er blevet etableret som en forudsigelig tidlig indikator for svær HF [20]. Opfølgningsundersøgelser har vist, at patienter med ALVD udviser en gennemsnitlig årlig kronisk hjertesvigtsrate på 4,9 til 20 %, med en dødelighed på 5,1 til 10,5 % [21], [22]. Disse observationer blev for nylig bekræftet i en 5-års overlevelsesrate, der viste en dødsrate på 31% for forsøgspersoner med fra ALVD og på 47% for patienter, der lider af systolisk HF [23]. Endelig viste SOLVD-undersøgelsen, at behandlingen af ​​ALVD betydeligt kan forsinke forekomsten af ​​HF [24]. Derfor kan det være af største klinisk betydning at identificere ALVD-individer i den generelle befolkning, før de udvikler åbenlys HF.

Der er en mangel på forsøg, der undersøgte de genetiske biomarkører, der er specifikke for patienter med iskæmisk hjertesygdom (IHD) (med eller uden tidligere historie med akut myokardieinfarkt) eller DCM-patienter, der opretholdt en normal venstre ventrikelfunktion (stadie B), IHD- eller DCM-patienter med typisk symptomatisk hjertesvigt (stadie C) og IHD- eller DCM-patienter, der udvikler sig til dekompenseret hjertesvigt (stadie D). Maciejak et al, [25] undersøgte de genetiske biomarkører for IHD-patienter med akut myokardieinfarkt (AMI), som udviklede venstre ventrikulær dysfunktion VS. patienter med akut myokardieinfarkt, som bibeholdt normal ventrikulær ejektionsfraktion på samme tid. De demonstrerede en ændret genekspressionsprofil i AMI, der udviklede HF. Sweet et al, [26] analyserede hele transkriptomer i iskæmisk kardiomyopati (ICM)-patienter og DCM-patienter VS raske patienter uden historie med kardiovaskulære sygdomme. De fandt vigtige ætiologi-specifikke signaturer, der karakteriserede ICM og DCM. Tijsen et al, [27] udførte mikro-RNA-array hos raske forsøgspersoner, patienter med hjertesvigt, patienter med dyspnø på grund af hjertesvigt og patienter med dyspnø af andre årsager end hjertesvigt. De identificerede 6 miRNA'er, der er forhøjet hos patienter med HF, blandt hvilke miR423-5p var stærkest relateret til den kliniske diagnose af HF. Smih F et al, [28] undersøgte, ved mikroarray-analyse, specifik genekspressionsprofil for asymptomatisk venstre ventrikulær dysfunktion, nemlig præ-hjertesvigt patienter. Ingen af ​​de ovennævnte forsøg undersøgte genekspressionsprofiler eller genetiske biomarkørsignaturer, der er specifikke for progressive symptomatiske stadier af hjertesvigt VS. præklinisk hjertesvigtstadie.

Tidligere mikroarray-undersøgelser afslørede distinkte genekspressionssignaturer mellem HF-ætiologier [28-33]; men andre formåede ikke at finde distinktioner [34, 35]. Direkte RNA-sekventering (RNA-seq) giver også nøjagtig kvantificering af transkripter og er blevet brugt til at identificere ekspressionssignaturer mellem HF og ikke-svigtende (NF) hjerter [36], nye transkriptionelle regulatorer og forstyrrede miRNA-netværk i ICM eller DCM [37 , 38], præ- og post-LVAD-transkriptomer [39, 40], almindelige HF-gener i pædiatrisk kardiomyopati [41] og splejsning, eQTL og allelekspression i DCM [42].

Vi antager, at den fulde forståelse af de specifikke genetiske variationer såsom genoverekspression eller gendysregulering i sådanne kohorter af patienter med IHD eller DCM, som udvikler sig til senere stadier af hjertesvigt VS. IHD- eller DCM-patienter, som bevarer normal systolisk funktion, kan bane vejen for at finde ud af diagnostiske genetiske biomarkører for IHD-patienter og DCM-patienter med høj risiko for progression til senere stadier af hjertesvigt. Desuden kan det at finde ud af differentielle genekspressionsprofiler hos IHD- og DCM-personer på forskellige stadier af hjertesvigt være det første skridt for innovationen af ​​nye genterapier til forebyggelse af hjertesvigtprogression hos IHD-patienter på stadium B og restitution af IHD-patienter ved progressive stadier af hjertesvigt (C og D).

B.7. Fremgangsmåde og metode:

1. Projektledelse og konsortium

2. Patientrekruttering og -allokering Protokollen for denne undersøgelse vil blive udformet og gennemgået i vid udstrækning af det institutionelle revisionsudvalg på Asyut Universitys pædagogiske kardiologiske hospital. Alle patienter vil blive bedt om at underskrive et detaljeret informeret samtykke inden rekruttering.

   Inklusionskriterier: IHD- eller DCM-patienter uden HF-symptomer (stadie B), med typiske HF-symptomer (stadie C) og patienter med dekompenseret HF (stadie D).

   Eksklusionskriterier: Patienter med andre strukturelle hjertesygdomme end IHD eller DCM.

   IHD-patienter eller DCM-patienter, der følges op på Assyut Universitys pædagogiske kardiologiske hospital, vil blive rekrutteret i denne undersøgelse.

   Alle rekrutterede patienter vil gennemgå fuldstændige laboratorieundersøgelser og fuldstændig fysisk undersøgelse af mindst to kardiologer på hospitalet. Alle patienter vil gennemgå ekkokardiografisk undersøgelse for strukturel hjertesygdomsdetektion og bekræftelse og nøjagtig måling af ejektionsfraktion for hjertesvigtstadieinddeling.

   Rekrutterede patienter vil blive allokeret til en af ​​undersøgelsesgrupperne i henhold til det aktuelle kliniske stadium af hjertesvigt.

   Gruppe A: IHD-patienter uden kliniske symptomer på hjertesvigt og normal venstre ventrikulær systolisk funktion (præklinisk stadium eller stadium B hjertesvigt) Gruppe B: IHD-patienter med typiske kliniske symptomer på hjertesvigt sammen med reduceret ejektionsfraktion < 35 % ( stadium C hjertesvigt) Gruppe C: IHD-patienter med dekompenseret hjertesvigt (stadie D hjertesvigt) Gruppe D: DCM-patienter uden kliniske symptomer på hjertesvigt og normal venstre ventrikulær systolisk funktion (præklinisk stadium eller stadium B hjertesvigt) Gruppe E: DCM-patienter med typiske kliniske symptomer på hjertesvigt sammen med reduceret ejektionsfraktion < 35 % (stadie C hjertesvigt) Gruppe F: DCM-patienter med dekompenseret hjertesvigt (stadie D hjertesvigt)

   Patienter vil blive rekrutteret fra de eksterne kardiologiske klinikker, intern kardiologisk afdeling og intensiv hjerteafdeling på Assyut University, der underviser i kardiologisk hospital.

   Prøvestørrelsesberegning Vi beregner stikprøvestørrelsen for IHD-patienter i henhold til ligningen for prøvestørrelsen af ​​beskrivende undersøgelsesdesign (43) baseret på prævalensen af ​​total CHD-prævalens er 6,7 % hos voksne i USA ≥ 20 år og prævalensen af ​​DCM er 5-8 pr. 100.000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Prøvestørrelse Z1-α/2= Repræsenterer antallet af standardfejl fra middelværdien (konstant = 1,96) P= Repræsenter andelen af ​​det bedste gæt om værdien af ​​andelen af ​​interesse. = prævalens D= den absolutte præcision, der kræves på hver side af proportionen eller afstanden; hvor tæt på andelen af ​​interesse skønnet ønskes. 0,05.

   Den nødvendige stikprøvestørrelse for IHD-patienter baseret på prævalensraten på 0,067 vil være 96 patienter.

   Den nødvendige stikprøvestørrelse for DCM-patienter baseret på prævalensraten på 0,008 vil være 11 patienter. Den samlede prøvestørrelse (inklusive kontrolpersoner) er 107 patienter.

3. Hjertebiopsi

   Bioptom vil blive brugt til ventrikulær vævsekstraktion (biopsi). De ekstraherede prøver vil blive opbevaret i flydende nitrogen ved -80 grader Celsius.

4. Import af kits, kemikalier og forbrugsvarer
5. RNA-ekstraktion Total RNA vil blive ekstraheret fra vævsprøver fra patienter med forskellige kliniske hjertesvigtsstadier og raske mennesker, der bruger Tempus TM spin RNA-isoleringskit i Tempus TM Blood RNA Tube anbefalet af producentens instruktion (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (Bilag A)

7- RNA-sekventering

(Thermofisher Ion Torrent-platform): mulighed A

Virkelig komplet transkriptomisolering til næste generations sekventeringsanalyse vil blive produceret ved hjælp af RiboMinus™ Eukaryote System v2 (tillæg C). Ion Total RNA-Seq Kit v2 vil blive brugt til simpel RNA-bibliotekskonstruktion (tillæg D). Ion Chef-systemet vil blive brugt til klargøring af skabeloner og chippåfyldning (bilag E). Ion GeneStudio S5-systemerne vil blive brugt til sekventering af genpaneler hele vejen til transkriptomet (appendiks F). Torrent Suite Software leverer automatisk sekvenslæsningen i eksporterbare FASTQ- eller BAM-formater (bilag G).

8- Bioinformatik og dataanalyse

Torrent Suite-softwaren "RNASeqAnalysis"-plugin vil blive brugt til indledende analyse, herunder RNA-transkriptjustering og kvantificering. Vi vil bruge hg19 som et humant referencegenom, hvor fulde og delvise justeringer vil blive påvist ved hjælp af både STAR og Bowtie2 kortlæggere. Picard-værktøjer vil blive anvendt til at tælle læsninger tilpasset hvert gen, mens manchetknapper-software vil blive brugt til at repræsentere forskellige isoformer for hvert gen. Der vil blive genereret omfattende plots for individuelle prøver, såvel som plots, der sammenligner prøver. Den yderligere specifikke analyse vil blive opnået ved hjælp af internt udviklede scripts (i python eller R) til fold-ændringsberegning, identifikation af op- og nedregulerede gener/isoformer og pathway-berigelsesanalyse ved hjælp af Cytoscape-software. Pathway berigelse analyse kan identificere veje, der kan have en rolle i sygdommen på en tidsserie data. Vi vil anvende en integrerende Multi-Omics-tilgang til at integrere og korrelere data, vi har opnået fra begge typer data (RNA-Seq).

9- manuskriptskrivning og udgivelse

Vi forventer, at publiceringen af ​​dette projekt resulterer i mindst to tidsskrifter med høj effektfaktor inden for molekylærgenetik og kardiologi.

B.8. Kvalifikationer og kompetencer (max 2 sider):

Den vigtigste kvalifikation er tilgængeligheden af ​​professionelle kardiologiske og molekylærgenetiske eksperter, som vil være i stand til hurtigt at gennemføre undersøgelsen. Også meget dyre fundamentalt kritiske instrumenter, der kræves til både mikroarray-genekspressionsprofilering og hel transkriptomion torrent RNA-sekventering er tilgængelige i de molekylære laboratorier i det nationale forskningscenter, Magdy Yaacoub Foundation og mange andre private molekylære laboratorier i Egypten.

De vigtigste kompetencer er de høje omkostninger ved de kits, kemikalier, forbrugsvarer og nogle mindre instrumenter, der bør købes for at gennemføre projektet fuldstændigt.