Genética da Cardiomiopatia Isquêmica

B.3. Resultados e Impacto:

É uma grande honra que sir Magdy yacoub revisou este projeto mais de uma vez e é uma grande honra para mim e para toda a equipe do projeto que ele, sir Magdy yaq. Aceitou ser o co-investigador deste projeto, e isso reflete verdadeiramente seu patriotismo e sua preocupação com tudo que é do interesse da saúde dos egípcios Descobrir biomarcadores genéticos e assinaturas que tipificam pacientes com cardiomiopatia isquêmica e pacientes com cardiomiopatia dilatada no pré-clínico estágio de insuficiência cardíaca, estágio clínico sintomático de insuficiência cardíaca e estágio final de insuficiência cardíaca descompensada. Esses biomarcadores específicos podem ser muito usados ​​como biomarcadores de diagnóstico para pacientes com DIC e DCM com risco extremamente alto de progressão para estágios posteriores de insuficiência cardíaca severamente sintomática. A triagem precoce desses pacientes pode ajudar a prevenir sua progressão para estágios posteriores de insuficiência cardíaca por meio de monitoramento rigoroso e estratégias terapêuticas e não terapêuticas. Levamos em consideração que os agentes farmacológicos tradicionais usados ​​para retardar ou prevenir a progressão de pacientes com insuficiência cardíaca tipicamente sintomática - principalmente betabloqueadores e inibidores da enzima conversora de angiotensina - já são prescritos para todos os pacientes com DIC sem eficácia comprovada para prevenir a progressão dessas pacientes com insuficiência cardíaca típica (pacientes com disfunção ventricular esquerda). Com base na hipótese acima, há uma grande necessidade de novas terapias que possam impedir a progressão de pacientes com doença cardíaca estrutural (insuficiência cardíaca em estágio B) para pacientes com insuficiência cardíaca típica e em estágio final (insuficiência cardíaca em estágio C e D).

Os resultados esperados podem explicar novas vias genéticas da progressão clínica de doença cardíaca estrutural assintomática (fase B da insuficiência cardíaca) para insuficiência cardíaca tipicamente sintomática (fase C) e insuficiência cardíaca descompensada (fase D).

Os resultados esperados deste projeto podem nos levar à nova fundação do primeiro banco de dados egípcio dos biomarcadores genéticos de diferentes estágios de insuficiência cardíaca com IHD ou DCM subjacente.

A novidade da ideia e nosso plano de utilizar as mais recentes técnicas de perfis de expressão gênica e as mais atualizadas metodologias de bioinformática podem abrir caminho para a publicação dos resultados deste trabalho em revistas de alto fator de impacto tanto na área de genética molecular quanto na de cardiologia.

O resultado esperado deste projeto pode ser uma referência para muitos candidatos a mestrados e doutorados na área de insuficiência cardíaca e genética molecular cardíaca no Egito e no mundo. A novidade da ideia, visto que, até onde sabemos, não há estudos anteriores que tenham investigado o perfil da expressão gênica específica em diferentes estágios da insuficiência cardíaca, pode atrair alto índice de citação por cientistas especializados na área.

A triagem precoce de pacientes com doença cardíaca estrutural assintomática com alto risco de desenvolvimento de estágios de insuficiência cardíaca progressiva pode ajudar a prevenir sua progressão por estratégias farmacológicas e não farmacológicas. Isso pode contribuir para economizar uma enorme quantidade de dinheiro do governo gasto no cuidado e no tratamento desses pacientes em estágios descompensados ​​gravemente sintomáticos da insuficiência cardíaca.

O plano dos pesquisadores é usar ainda mais as informações que serão reveladas neste projeto para aplicar as técnicas mais recentemente investigadas de ativação e repressão de RNA para tratar com superexpressão gênica e desregulação gênica em pacientes que sofrem estágios progressivos de insuficiência cardíaca VS. aqueles em estágios primários assintomáticos de insuficiência cardíaca para preparar o caminho para a nova terapia genética inovadora para a prevenção da progressão de estágios primários para estágios progressivos de insuficiência cardíaca e a recuperação de pacientes com insuficiência cardíaca em estágio final para os estágios normais de estilo de vida assintomáticos estáveis ​​do doença. Esta nova terapia não só contribuirá para mitigar a miséria de um número tão grande de egípcios que sofrem desta doença altamente incapacitante, mas também será um avanço científico revolucionário no campo da terapia genética em todo o mundo. Estamos cheios de fé que somos os egípcios que podem fazer milagres pela paciência, determinação, luta e crença em nosso sonho.

B.4. Estado da Arte e Excelência:

A insuficiência cardíaca (IC) afeta cerca de 6,5 milhões de americanos adultos [1]. Embora as taxas de sobrevivência tenham aumentado 10% entre 1979 e 2000, a atual taxa de mortalidade em 5 anos ainda é de cerca de 50% [1, 2]. Um paradigma de longa data é que a insuficiência cardíaca em estágio terminal com fração de ejeção reduzida (ICFEr) evolui por uma "via final comum", apesar de ter uma ampla variedade de etiologias e contribuições genéticas [3, 4]. Os resultados dos ensaios clínicos e as diretrizes atuais para o manejo da ICFEr confirmam esse ponto de vista e direcionam a terapia baseada principalmente no grau de fração de ejeção do ventrículo esquerdo e na gravidade clínica usando a classificação da New York Heart Association (NYHA) [5].

A doença cardíaca isquêmica (DIC) é a causa mais comum de morte globalmente, de acordo com relatórios da OMS, e é a principal causa de insuficiência cardíaca nos países desenvolvidos [6-9]. Insuficiência cardíaca secundária à DIC tem sido associada independentemente a taxas de mortalidade mais altas em comparação com uma etiologia não isquêmica [10, 11]. O aumento da incidência tem sido atribuído à alta eficácia da intervenção trombolítica e coronária percutânea primária no tratamento de infartos agudos do miocárdio, levando a uma melhor sobrevida do paciente, porém muitas vezes levando a um aumento da morbidade devido à remodelação ventricular esquerda (VE) e ventrículo esquerdo crônico disfunção. O termo cardiomiopatia isquêmica (ICM) foi definido como disfunção sistólica do VE com um ou mais dos seguintes: história de revascularização miocárdica prévia ou infarto do miocárdio, mais de 75% de estenose no tronco principal esquerdo ou artéria descendente anterior esquerda, ou dois vasos ou mais com estenose superior a 75% [12].

Uma das causas mais comuns de insuficiência cardíaca são as cardiomiopatias. A American Heart Association descreveu as cardiomiopatias como um grupo heterogêneo de doenças do miocárdio, predominantemente genéticas e associadas a disfunções mecânicas e/ou elétricas [13]. A CMD é caracterizada pela presença de dilatação ventricular ou biventricular esquerda e disfunção sistólica na ausência de condições anormais de carga. É a segunda causa mais comum de insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida. DCM é um distúrbio complexo com diversas variantes genéticas e fatores ambientais que determinam o início da doença e o curso da doença [14, 15].

A DIC e as cardiomiopatias induzem modificação da estrutura do miocárdio e podem levar a l alterações da função cardíaca [16] incluindo redução da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE). A identificação de pacientes na fase "pré-insuficiência cardíaca" pode prevenir o desenvolvimento de IC por meio da implementação de estratégias médicas e não médicas adaptadas. Este estado silencioso pré-clínico (pré-insuficiência cardíaca) é referido como disfunção ventricular esquerda assintomática (DALV) e só pode ser discriminado por ecocardiografia transtorácica. ALVD, comum na população em geral, leva a um alto risco de desenvolver IC manifesta. De fato, indivíduos com ALVD têm um aumento de 12 vezes na taxa anual de hospitalização por IC de primeiro evento em comparação com indivíduos com FEVE normal [17] e um aumento de 4 vezes no risco de morte em um período de 6 anos [16] . A triagem efetiva em larga escala para ALVD, representando um grande desafio clínico não atendido, requer a determinação de biomarcadores de ALVD.

A triagem para ALVD começou há mais de uma década [17], [18]. No entanto, não há biomarcadores ALVD. De fato, o diagnóstico de ALVD justifica uma análise ecocardiográfica complicada, que é demorada, cara e não aplicável à grande população de indivíduos em risco. A falta de biomarcador(es) pode ser de grande importância porque ALVD é altamente prevalente devido ao aumento geral de fatores de risco cardiovascular [19]. ALVD foi estabelecida como um indicador preditivo precoce de IC grave [20]. Estudos de acompanhamento mostraram que pacientes com ALVD apresentam uma taxa média anual de insuficiência cardíaca crônica de 4,9 a 20%, com uma taxa de mortalidade de 5,1 a 10,5% [21], [22]. Essas observações foram recentemente confirmadas em uma análise da taxa de sobrevida de 5 anos que demonstrou uma taxa de mortalidade de 31% para indivíduos com ALVD e de 47% para pacientes com IC sistólica [23]. Finalmente, o estudo SOLVD demonstrou que o tratamento da ALVD pode retardar significativamente a ocorrência de IC [24]. Portanto, pode ser de extrema importância clínica identificar indivíduos com ALVD na população em geral antes que eles desenvolvam IC evidente.

Há uma escassez de estudos que investigaram os biomarcadores genéticos específicos para pacientes com doença cardíaca isquêmica (DIC) (com ou sem história prévia de infarto agudo do miocárdio) ou pacientes com DCM que mantiveram uma função ventricular esquerda normal (estágio B), DIC ou pacientes com DCM com insuficiência cardíaca sintomática típica (estágio C) e pacientes com DIC ou CMD que progridem para insuficiência cardíaca descompensada (estágio D). Maciejak et al, [25] investigaram os biomarcadores genéticos de pacientes com DIC com infarto agudo do miocárdio (IAM) que desenvolveram disfunção ventricular esquerda VS. pacientes com infarto agudo do miocárdio que retiveram fração de ejeção ventricular normal ao mesmo tempo. Eles demonstraram um perfil de expressão gênica alterado no IAM que desenvolveu IC. Sweet et al, [26] analisaram o transcriptoma total em pacientes com cardiomiopatia isquêmica (ICM) e pacientes com DCM versus pacientes saudáveis ​​sem histórico de doenças cardiovasculares. Eles encontraram assinaturas específicas de etiologia chave que tipificavam ICM e DCM. Tijsen et al, [27] realizaram arranjo de microRNA em indivíduos saudáveis, pacientes com insuficiência cardíaca, pacientes com dispneia devido a insuficiência cardíaca e pacientes com dispneia por outras causas que não insuficiência cardíaca. Eles identificaram 6 miRNAs elevados em pacientes com IC, entre os quais o miR423-5p foi o mais fortemente relacionado ao diagnóstico clínico de IC. Smih F et al, [28] investigaram, por análise de microarray, o perfil de expressão gênica específica para disfunção ventricular esquerda assintomática, ou seja, pacientes com pré-insuficiência cardíaca. Nenhum dos ensaios acima mencionados investigou os perfis de expressão gênica ou assinaturas de biomarcadores genéticos específicos para estágios sintomáticos progressivos de insuficiência cardíaca VS. estágio pré-clínico de insuficiência cardíaca.

Estudos anteriores de microarrays revelaram assinaturas distintas de expressão gênica entre as etiologias da IC [28-33]; mas outros falharam em encontrar distinções [34, 35]. O sequenciamento direto de RNA (RNA-seq) também fornece quantificação precisa de transcrições e tem sido usado para identificar assinaturas de expressão entre corações HF e não falidos (NF) [36], novos reguladores transcricionais e redes de miRNA perturbadas em ICM ou DCM [37 , 38], transcriptomas pré e pós-LVAD [39, 40], genes HF comuns em cardiomiopatia pediátrica [41] e splicing, eQTL e expressão alélica em DCM [42].

Nossa hipótese é que a compreensão completa das variações genéticas específicas, como superexpressão gênica ou desregulação gênica em tais coortes de pacientes com DIC ou CMD que progridem para estágios posteriores de insuficiência cardíaca VS. Pacientes com DIC ou DCM que mantêm a função sistólica normal podem abrir caminho para descobrir biomarcadores genéticos diagnósticos de pacientes com DIC e pacientes com DCM com alto risco de progressão para estágios posteriores de insuficiência cardíaca. Além disso, descobrir perfis de expressão gênica diferencial em indivíduos com DIC e DCM em diferentes estágios de insuficiência cardíaca pode ser o primeiro passo para a inovação de novas terapias gênicas para prevenção da progressão da insuficiência cardíaca em pacientes com DIC no estágio B e na recuperação de pacientes com DIC no estágio B. estágios progressivos de insuficiência cardíaca (C e D).

B.7. Abordagem e Metodologia:

1. Gestão de projetos e consórcio

2. Recrutamento e alocação de pacientes O protocolo deste estudo será extensivamente elaborado e revisado pelo conselho de revisão institucional do hospital educacional de cardiologia da Asyut University. Todos os pacientes serão solicitados a assinar um consentimento informado detalhado antes do recrutamento.

   Critérios de inclusão: pacientes com DIC ou CMD sem sintomas de IC (estágio B), com sintomas típicos de IC (estágio C) e pacientes com IC descompensada (estágio D).

   Critérios de exclusão: Pacientes com cardiopatias estruturais que não sejam IHD ou DCM.

   Pacientes com DIC ou DCM acompanhados no hospital educacional de cardiologia da Universidade Assyut serão recrutados neste estudo.

   Todos os pacientes recrutados passarão por exames laboratoriais completos e exame físico completo por pelo menos dois cardiologistas do hospital. Todos os pacientes serão submetidos a exame ecocardiográfico para detecção e confirmação de cardiopatia estrutural e aferição precisa da fração de ejeção para estadiamento da insuficiência cardíaca.

   Os pacientes recrutados serão alocados em um dos grupos de estudo de acordo com o estágio clínico atual da insuficiência cardíaca.

   Grupo A: pacientes com DIC sem sintomas clínicos de insuficiência cardíaca e função sistólica ventricular esquerda normal (fase pré-clínica ou insuficiência cardíaca estágio B) Grupo B: pacientes com DIC com sintomas clínicos típicos de insuficiência cardíaca juntamente com fração de ejeção reduzida < 35% ( insuficiência cardíaca estágio C) Grupo C: pacientes com DIC com insuficiência cardíaca descompensada (insuficiência cardíaca estágio D) Grupo D: pacientes com DCM sem sintomas clínicos de insuficiência cardíaca e função sistólica ventricular esquerda normal (fase pré-clínica ou insuficiência cardíaca estágio B) Grupo E: pacientes com DCM com sintomas clínicos típicos de insuficiência cardíaca juntamente com fração de ejeção reduzida < 35% (insuficiência cardíaca estágio C) Grupo F: pacientes com DCM com insuficiência cardíaca descompensada (insuficiência cardíaca estágio D)

   Os pacientes serão recrutados nas clínicas externas de cardiologia, departamento interno de cardiologia e unidade de terapia intensiva cardíaca do Hospital Universitário de Cardiologia Assyut.

   Cálculo do tamanho da amostra Calculamos o tamanho da amostra de pacientes com DIC de acordo com a equação para o tamanho da amostra do desenho do estudo descritivo (43) com base na prevalência de A prevalência total de DCC é de 6,7% em adultos dos EUA ≥ 20 anos de idade e na prevalência de DCM é 5-8 por 100000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Tamanho da amostra Z1-α/2= Representa o número de erros padrão da média (constante = 1,96) P= Representa a proporção do melhor palpite sobre o valor da proporção de interesse. = prevalência D= a precisão absoluta exigida em ambos os lados da proporção, ou a distância; o quão próximo da proporção de interesse a estimativa é desejada. 0,05.

   O tamanho da amostra necessário para pacientes com DIC com base na taxa de prevalência de 0,067 será de 96 pacientes.

   O tamanho da amostra necessário para pacientes com DCM com base na taxa de prevalência de 0,008 será de 11 pacientes. O tamanho total da amostra (incluindo indivíduos de controle) é de 107 pacientes.

3. Biópsia cardíaca

   O biótomo será utilizado para extração de tecido ventricular (biópsia). Os espécimes extraídos serão reservados em nitrogênio líquido em -80 graus Celsius.

4. Importação de kits, produtos químicos e consumíveis
5. Extração de RNA O RNA total será extraído de amostras de tecido de pacientes com diferentes estágios clínicos de insuficiência cardíaca e pessoas saudáveis ​​usando o Tempus TM spin RNA Isolation Kit em Tempus TM Blood RNA Tube recomendado pelas instruções do fabricante (Life Technologies Invitrogen, EUA). (45) (Apêndice A)

7- Sequenciamento de RNA

(plataforma Thermofisher Ion Torrent): opção A

O isolamento verdadeiramente completo do transcriptoma para análise de sequenciamento de próxima geração será produzido usando o RiboMinus™ Eukaryote System v2 (Apêndice C). O Ion Total RNA-Seq Kit v2 será usado para construção simples de biblioteca de RNA (Apêndice D). O Ion Chef System será usado para preparação de modelo e carregamento de chip (Apêndice E). Os sistemas Ion GeneStudio S5 serão utilizados para sequenciamento de painéis de genes até o transcriptoma (Apêndice F). O software Torrent Suite fornece automaticamente as leituras de sequência em formatos FASTQ ou BAM exportáveis ​​(Apêndice G).

8- Bioinformática e análise de dados

O plug-in "RNASeqAnalysis" do software Torrent Suite será empregado para análise inicial, incluindo alinhamento e quantificação do transcrito de RNA. Usaremos o hg19 como genoma humano de referência, onde alinhamentos completos e parciais serão detectados usando os mapeadores STAR e Bowtie2. Ferramentas de Picard serão aplicadas para contar reads alinhados a cada gene, enquanto o software de abotoaduras será usado para representar diferentes isoformas para cada gene. Gráficos abrangentes serão gerados para amostras individuais, bem como gráficos comparando amostras. A análise específica adicional será realizada usando scripts desenvolvidos internamente (em python ou R) para cálculo de alteração de dobra, identificando genes/isoformas regulados para cima e para baixo e análise de enriquecimento de via usando o software Cytoscape. A análise de enriquecimento de vias pode identificar vias que podem ter um papel na doença em dados de séries temporais. Aplicaremos uma abordagem Multi-Omics integrativa para integrar e correlacionar dados obtidos de ambos os tipos de dados (RNA-Seq).

9- redação e publicação do manuscrito

Esperamos a publicação dos resultados deste projeto em pelo menos dois periódicos de alto fator de impacto na área de genética molecular e na área de cardiologia.

B.8. Qualificações e competências (max 2 páginas):

A qualificação mais importante é a disponibilidade de cardiologia profissional e especialistas em genética molecular que serão capazes de conduzir o estudo rapidamente. Além disso, instrumentos fundamentalmente críticos e altamente caros necessários para o perfil de expressão gênica de microarray e o sequenciamento de RNA de torrent de íons de transcriptoma completo estão disponíveis nos laboratórios moleculares do centro de pesquisa nacional, da fundação Magdy Yaacoub e em muitos outros laboratórios moleculares privados no Egito.

As competências mais importantes são o alto custo dos kits, produtos químicos, consumíveis e alguns instrumentos menores que devem ser adquiridos para a condução completa do projeto.