Génétique de la cardiomyopathie ischémique

B.3. Résultats et impact :

C'est un grand honneur que monsieur Magdy yacoub ait révisé ce projet plus d'une fois et c'est un grand honneur pour moi et toute l'équipe du projet que monsieur Magdy yaq. Accepté d'être le co-investigateur de ce projet, Et cela reflète vraiment son patriotisme et son souci pour tout ce qui est dans l'intérêt de la santé des Égyptiens Découvrir les biomarqueurs génétiques et les signatures qui caractérisent les patients atteints de cardiomyopathie ischémique et les patients atteints de cardiomyopathie dilatée au stade préclinique stade d'insuffisance cardiaque, stade clinique symptomatique d'insuffisance cardiaque et insuffisance cardiaque terminale décompensée. Ces biomarqueurs spécifiques peuvent être largement utilisés comme biomarqueurs diagnostiques pour les patients IHD et DCM présentant un risque extrêmement élevé de progression vers des stades ultérieurs sévèrement symptomatiques de l'insuffisance cardiaque. Le dépistage précoce de ces patients peut aider à prévenir leur progression vers des stades ultérieurs d'insuffisance cardiaque par une surveillance étroite et des stratégies thérapeutiques et non thérapeutiques. Nous avons tenu compte du fait que les agents pharmacologiques traditionnels utilisés pour ralentir ou prévenir la progression des patients atteints d'insuffisance cardiaque typiquement symptomatique - principalement les bêtabloquants et les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine - sont déjà prescrits à tous les patients atteints d'IHD sans efficacité prouvée pour prévenir la progression de ceux-ci. aux patients atteints d'insuffisance cardiaque typique (patients atteints de dysfonction ventriculaire gauche). Sur la base de l'hypothèse ci-dessus, il existe un grand besoin de nouvelles thérapies susceptibles d'empêcher la progression des patients atteints d'une maladie cardiaque structurelle (insuffisance cardiaque de stade B) vers des patients atteints d'insuffisance cardiaque typique et en phase terminale (insuffisance cardiaque de stade C et D).

Les résultats attendus peuvent expliquer de nouvelles voies génétiques de la progression clinique du trouble cardiaque structurel asymptomatique (insuffisance cardiaque de stade B) vers une insuffisance cardiaque typiquement symptomatique (stade C) et une insuffisance cardiaque décompensée (stade D).

Les résultats attendus de ce projet pourraient nous conduire à la nouvelle fondation de la première base de données égyptienne des biomarqueurs génétiques de différents stades d'insuffisance cardiaque avec IHD ou DCM sous-jacents.

La nouveauté de l'idée et notre intention d'utiliser les techniques de profilage d'expression génique les plus récentes et les méthodologies bioinformatiques les plus récentes pourraient ouvrir la voie à la publication des résultats de ce travail dans une revue à facteur d'impact élevé, tant dans le domaine de la génétique moléculaire que dans celui de la cardiologie.

Le résultat attendu de ce projet pourrait être une référence pour de nombreux candidats à la maîtrise et au doctorat dans le domaine de l'insuffisance cardiaque et de la génétique moléculaire cardiaque en Égypte et dans le monde. La nouveauté de l'idée, étant donné que - pour la plupart de nos connaissances - il n'y a pas d'études antérieures qui ont étudié le profilage de l'expression génique spécifique à différents stades de l'insuffisance cardiaque, peut attirer un score élevé de citation par des scientifiques spécialisés dans le domaine.

Le dépistage précoce des patients atteints de cardiopathie structurelle asymptomatique à haut risque de développement de stades d'insuffisance cardiaque progressive peut aider à prévenir leur progression par des stratégies pharmacologiques et non pharmacologiques. Cela peut contribuer à économiser une énorme somme d'argent du gouvernement dépensée pour les soins et le traitement de ces patients à des stades décompensés sévèrement symptomatiques de l'insuffisance cardiaque.

Le plan des chercheurs est d'utiliser davantage les informations qui seront révélées dans ce projet pour appliquer les techniques d'activation et de répression de l'ARN les plus récemment étudiées pour traiter la surexpression génique et la dérégulation génique chez les patients souffrant de stades progressifs d'insuffisance cardiaque VS. ceux aux stades asymptomatiques primaires de l'insuffisance cardiaque pour ouvrir la voie à la nouvelle thérapie génique innovante pour la prévention de la progression des stades primaires aux stades progressifs de l'insuffisance cardiaque et la récupération des patients atteints d'insuffisance cardiaque en phase terminale vers les stades de mode de vie normaux asymptomatiques stables de la maladie. Cette nouvelle thérapie contribuera non seulement à atténuer la misère d'un si grand nombre d'Égyptiens souffrant de cette maladie très invalidante, mais elle constituera également une percée scientifique révolutionnaire dans le domaine de la thérapie génique dans le monde entier. Nous sommes pleins de foi que nous sommes l'Égyptien peut faire des miracles par la patience, la détermination, la lutte et la croyance en notre rêve.

B.4. État de l'art et excellence :

L'insuffisance cardiaque (IC) touche environ 6,5 millions d'adultes américains [1]. Bien que les taux de survie aient augmenté de 10 % entre 1979 et 2000, le taux de mortalité actuel à 5 ​​ans est toujours d'environ 50 % [1, 2]. Un paradigme de longue date est que l'insuffisance cardiaque terminale avec fraction d'éjection réduite (HFrEF) évolue via une "voie finale commune" malgré une grande variété d'étiologies et de contributions génétiques [3, 4]. Les résultats des essais cliniques et les recommandations actuelles pour la prise en charge de la HFrEF confirment ce point de vue et orientent la thérapie basée principalement sur le degré de fraction d'éjection ventriculaire gauche et la sévérité clinique en utilisant la classification de la New York Heart Association (NYHA) [5].

Selon les rapports de l'OMS, la cardiopathie ischémique (CI) est la cause la plus fréquente de décès dans le monde et la principale cause d'insuffisance cardiaque dans les pays développés [6-9]. L'insuffisance cardiaque secondaire à une IHD s'est avérée être indépendamment associée à des taux de mortalité plus élevés par rapport à une étiologie non ischémique [10, 11]. L'incidence croissante a été attribuée à la grande efficacité de l'intervention thrombolytique et coronarienne percutanée primaire dans le traitement des infarctus aigus du myocarde, conduisant à une amélioration de la survie des patients, mais conduisant souvent à une morbidité accrue due au remodelage ventriculaire gauche (VG) et au ventricule gauche chronique. dysfonctionnement. Le terme cardiomyopathie ischémique (ICM) a été défini comme un dysfonctionnement systolique du VG avec un ou plusieurs des éléments suivants : des antécédents de revascularisation myocardique ou d'infarctus du myocarde, une sténose de plus de 75 % dans la tige principale gauche ou l'artère interventriculaire antérieure gauche, ou deux vaisseaux ou plus avec une sténose supérieure à 75 % [12].

Les cardiomyopathies sont l'une des causes les plus fréquentes d'insuffisance cardiaque. L'American Heart Association a décrit les cardiomyopathies comme un groupe hétérogène de maladies myocardiques à prédominance génétique et associées à un dysfonctionnement mécanique et/ou électrique [13]. La DCM se caractérise par la présence d'une dilatation ventriculaire ou biventriculaire gauche et d'un dysfonctionnement systolique en l'absence de conditions de charge anormales. C'est la deuxième cause d'insuffisance cardiaque avec une fraction d'éjection réduite. Le DCM est un trouble complexe avec diverses variantes génétiques et facteurs environnementaux qui déterminent l'apparition et l'évolution de la maladie [14, 15].

L'IHD et les cardiomyopathies induisent une modification de la structure du myocarde et peuvent entraîner des altérations de la fonction cardiaque [16] dont une diminution de la fraction d'éjection ventriculaire gauche (FEVG). L'identification des patients au stade « pré-insuffisance cardiaque » peut prévenir le développement de l'IC grâce à la mise en place de stratégies médicales et non médicales adaptées. Cet état préclinique silencieux (pré-insuffisance cardiaque) est appelé dysfonction ventriculaire gauche asymptomatique (ALVD) et ne peut être discriminé que par l'échocardiographie transthoracique. L'ALVD, fréquente dans la population générale, entraîne un risque élevé de développer une IC manifeste. En effet, les sujets ALVD ont une augmentation de 12 fois du taux annuel d'hospitalisation pour le premier événement IC par rapport aux individus avec une FEVG normale [17] et une augmentation de 4 fois du risque de décès sur une période de 6 ans [16] . Un dépistage efficace à grande échelle de l'ALVD, qui représente un défi clinique majeur non relevé, nécessite une détermination des biomarqueurs ALVD.

Le dépistage de l'ALVD a commencé depuis plus d'une décennie [17], [18]. Cependant, il n'y a pas de biomarqueurs ALVD. En effet, le diagnostic d'ALVD justifie une analyse échocardiographique compliquée, longue, coûteuse et non applicable à la grande population d'individus à risque. L'absence de biomarqueur(s) peut être d'une grande importance car la prévalence de l'ALVD est élevée en raison de l'augmentation générale des facteurs de risque cardiovasculaire [19]. L'ALVD a été établi comme un indicateur prédictif précoce de l'insuffisance cardiaque sévère [20]. Des études de suivi ont montré que les patients atteints d'ALVD présentaient un taux annuel moyen d'insuffisance cardiaque chronique de 4,9 à 20 %, avec un taux de mortalité de 5,1 à 10,5 % [21], [22]. Ces observations ont été récemment confirmées dans une analyse du taux de survie à 5 ans qui a démontré un taux de mortalité de 31 % pour les sujets atteints d'ALVD et de 47 % pour les patients souffrant d'IC ​​systolique [23]. Enfin, l'étude SOLVD a démontré que le traitement de l'ALVD peut retarder significativement la survenue de l'IC [24]. Par conséquent, il peut être de la plus haute importance clinique d'identifier les individus ALVD dans la population générale avant qu'ils ne développent une IC manifeste.

Il existe peu d'essais portant sur les biomarqueurs génétiques spécifiques aux patients atteints de cardiopathie ischémique (IHD) (avec ou sans antécédents d'infarctus aigu du myocarde) ou aux patients DCM qui ont maintenu une fonction ventriculaire gauche normale (stade B), aux patients IHD ou DCM avec une insuffisance cardiaque symptomatique typique (stade C) et des patients atteints d'IHD ou de DCM qui évoluent vers une insuffisance cardiaque décompensée (stade D). Maciejak et al, [25] ont étudié les biomarqueurs génétiques des patients IHD avec infarctus aigu du myocarde (IAM) qui ont développé une dysfonction ventriculaire gauche VS. patients atteints d'infarctus aigu du myocarde qui ont conservé une fraction d'éjection ventriculaire normale pendant la même durée. Ils ont démontré un profil d'expression génique altéré chez les AMI qui ont développé une HF. Sweet et al, [26] ont analysé le transcriptome entier chez des patients atteints de cardiomyopathie ischémique (ICM) et des patients DCM VS des patients sains sans antécédents de maladies cardiovasculaires. Ils ont trouvé des signatures clés spécifiques à l'étiologie qui caractérisaient l'ICM et le DCM. Tijsen et al, [27] ont réalisé des puces à micro-ARN chez des sujets sains, des patients insuffisants cardiaques, des patients souffrant de dyspnée due à une insuffisance cardiaque et des patients souffrant de dyspnée pour des causes autres que l'insuffisance cardiaque. Ils ont identifié 6 miARN qui sont élevés chez les patients atteints d'IC, parmi lesquels miR423-5p était le plus fortement lié au diagnostic clinique d'IC. Smih F et al, [28] ont étudié, par analyse de puces à ADN, un profil d'expression génique spécifique pour la dysfonction ventriculaire gauche asymptomatique, à savoir les patients en pré-insuffisance cardiaque. Aucun des essais mentionnés ci-dessus n'a étudié les profils d'expression génique ou les signatures de biomarqueurs génétiques spécifiques aux stades symptomatiques progressifs de l'insuffisance cardiaque VS. stade préclinique de l'insuffisance cardiaque.

Des études antérieures sur puces à ADN ont révélé des signatures d'expression génique distinctes entre les étiologies HF [28-33] ; mais d'autres n'ont pas trouvé de distinctions [34, 35]. Le séquençage direct de l'ARN (ARN-seq) fournit également une quantification précise des transcrits et a été utilisé pour identifier les signatures d'expression entre les cœurs HF et non défaillants (NF) [36], de nouveaux régulateurs transcriptionnels et des réseaux de miARN perturbés dans l'ICM ou le DCM [37 , 38], les transcriptomes pré- et post-LVAD [39, 40], les gènes HF courants dans la cardiomyopathie pédiatrique [41], et l'épissage, l'eQTL et l'expression allélique dans le DCM [42].

Nous émettons l'hypothèse que la pleine compréhension des variations génétiques spécifiques telles que la surexpression génique ou la dérégulation génique dans de telles cohortes de patients atteints d'IHD ou de DCM qui progressent vers des stades ultérieurs d'insuffisance cardiaque VS. Les patients IHD ou DCM qui conservent une fonction systolique normale peuvent ouvrir la voie à la découverte de biomarqueurs génétiques diagnostiques des patients IHD et DCM présentant un risque élevé de progression vers des stades ultérieurs d'insuffisance cardiaque. De plus, la découverte de profils d'expression génique différentiels chez les sujets IHD et DCM à différents stades de l'insuffisance cardiaque peut être la première étape pour l'innovation de nouvelles thérapies géniques pour la prévention de la progression de l'insuffisance cardiaque chez les patients IHD au stade B et la récupération des patients IHD à stades progressifs de l'insuffisance cardiaque (C et D).

B.7. Approche et Méthodologie :

1. Gestion de projet et consortium

2. Recrutement et affectation des patients Le protocole de cette étude sera largement conçu et revu par le comité d'examen institutionnel de l'hôpital de cardiologie éducative de l'Université d'Asyut. Tous les patients seront invités à signer un consentement éclairé détaillé avant le recrutement.

   Critères d'inclusion : Patients atteints d'IHD ou de DCM sans symptômes d'IC ​​(stade B), avec symptômes d'IC ​​typiques (stade C) et patients avec IC décompensée (stade D).

   Critères d'exclusion : Patients atteints de maladies cardiaques structurelles autres que l'IHD ou le DCM.

   Des patients IHD ou DCM suivis à l'hôpital de cardiologie éducative de l'Université Assyut seront recrutés dans cette étude.

   Tous les patients recrutés subiront des examens de laboratoire complets et un examen physique complet par au moins deux cardiologues à l'hôpital. Tous les patients subiront un examen échocardiographique pour la détection et la confirmation d'une maladie cardiaque structurelle et une mesure précise de la fraction d'éjection pour la stadification de l'insuffisance cardiaque.

   Les patients recrutés seront répartis dans l'un des groupes d'étude en fonction du stade clinique actuel de l'insuffisance cardiaque.

   Groupe A : patients atteints d'IHD sans symptômes cliniques d'insuffisance cardiaque et avec une fonction systolique ventriculaire gauche normale (insuffisance cardiaque de stade préclinique ou de stade B) Groupe B : patients atteints d'IHD présentant des symptômes cliniques typiques d'insuffisance cardiaque avec une fraction d'éjection réduite < 35 % ( insuffisance cardiaque de stade C) Groupe C : patients atteints d'IHD avec insuffisance cardiaque décompensée (insuffisance cardiaque de stade D) Groupe D : patients DCM sans symptômes cliniques d'insuffisance cardiaque et avec une fonction systolique ventriculaire gauche normale (stade préclinique ou insuffisance cardiaque de stade B) Groupe E : patients DCM présentant des symptômes cliniques typiques d'insuffisance cardiaque avec une fraction d'éjection réduite < 35 % (insuffisance cardiaque de stade C) Groupe F : patients DCM présentant une insuffisance cardiaque décompensée (insuffisance cardiaque de stade D)

   Les patients seront recrutés dans les cliniques de cardiologie externe, le service de cardiologie interne et l'unité de soins cardiaques intensifs de l'hôpital de cardiologie de l'université d'Assyut.

   Calcul de la taille de l'échantillon Nous calculons la taille de l'échantillon de patients IHD selon l'équation de la taille de l'échantillon de la conception descriptive de l'étude (43) basée sur la prévalence de la prévalence totale de coronaropathie est de 6,7 % chez les adultes américains de ≥ 20 ans et la prévalence de DCM est de 5 à 8 pour 100 000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Taille de l'échantillon Z1-α/2= Représente le nombre d'erreurs standard par rapport à la moyenne (constante = 1,96) P= Représente la proportion de la meilleure estimation de la valeur de la proportion d'intérêt. = prévalence D= la précision absolue requise de part et d'autre de la proportion, ou de la distance ; à quel point l'estimation doit être proche de la proportion d'intérêt. 0,05.

   La taille d'échantillon requise pour les patients atteints de CI sur la base du taux de prévalence de 0,067 sera de 96 patients.

   La taille de l'échantillon requise pour les patients DCM sur la base du taux de prévalence de 0,008 sera de 11 patients. La taille totale de l'échantillon (y compris les sujets témoins) est de 107 patients.

3. Biopsie cardiaque

   Bioptome sera utilisé pour l'extraction de tissu ventriculaire (biopsie). Les spécimens extraits seront réservés dans de l'azote liquide à - 80 degrés Celsius.

4. Importation de kits, produits chimiques et consommables
5. Extraction d'ARN L'ARN total sera extrait d'échantillons de tissus de patients présentant différents stades cliniques d'insuffisance cardiaque et de personnes en bonne santé à l'aide du kit d'isolement d'ARN spin Tempus TM dans le tube d'ARN sanguin Tempus TM recommandé par les instructions du fabricant (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (Annexe A)

7- Séquençage de l'ARN

(plateforme Thermofisher Ion Torrent) : option A

L'isolement véritablement complet du transcriptome pour l'analyse de séquençage de nouvelle génération sera produit à l'aide du système d'eucaryote RiboMinus™ v2 (annexe C). Le kit Ion Total RNA-Seq v2 sera utilisé pour la construction simple d'une bibliothèque d'ARN (annexe D). Le système Ion Chef sera utilisé pour la préparation des gabarits autonomes et le chargement des puces (annexe E). Les systèmes Ion GeneStudio S5 seront utilisés pour le séquençage des panels de gènes jusqu'au transcriptome (annexe F). Le logiciel Torrent Suite fournit automatiquement les lectures de séquences aux formats exportables FASTQ ou BAM (Annexe G).

8- Bioinformatique et analyse de données

Le plugin "RNASeqAnalysis" du logiciel Torrent Suite sera utilisé pour l'analyse initiale, y compris l'alignement et la quantification des transcriptions d'ARN. Nous utiliserons hg19 comme génome humain de référence, où les alignements complets et partiels seront détectés à l'aide des mappeurs STAR et Bowtie2. Les outils Picard seront appliqués pour compter les lectures alignées sur chaque gène, tandis que le logiciel de boutons de manchette sera utilisé pour représenter différentes isoformes pour chaque gène. Des graphiques complets seront générés pour des échantillons individuels, ainsi que des graphiques comparant des échantillons . L'analyse spécifique supplémentaire sera réalisée à l'aide de scripts développés en interne (en python ou R) pour le calcul du changement de pli, l'identification des gènes/isoformes régulés à la hausse et à la baisse et l'analyse de l'enrichissement des voies à l'aide du logiciel Cytoscape. L'analyse d'enrichissement des voies peut identifier les voies qui peuvent avoir un rôle dans la maladie sur une série de données chronologiques. Nous appliquerons une approche intégrative Multi-Omics pour intégrer et corréler les données que nous avons obtenues à partir des deux types de données (RNA-Seq).

9- rédaction et publication du manuscrit

Nous prévoyons la publication des résultats de ce projet dans au moins deux revues à facteur d'impact élevé dans le domaine de la génétique moléculaire et dans le domaine de la cardiologie.

B.8. Qualifications et compétences (max 2 pages):

La qualification la plus importante est la disponibilité d'experts professionnels en cardiologie et en génétique moléculaire qui seront en mesure de mener rapidement l'étude. En outre, des instruments fondamentalement critiques très coûteux nécessaires à la fois pour le profilage de l'expression génique des microréseaux et le séquençage de l'ARN torrent ionique du transcriptome entier sont disponibles dans les laboratoires moléculaires du centre national de recherche, la fondation Magdy Yaacoub et de nombreux autres laboratoires moléculaires privés en Égypte.

Les compétences les plus importantes sont le coût élevé des kits, des produits chimiques, des consommables et de certains instruments mineurs qui doivent être achetés pour la réalisation complète du projet.