Iskeemisen kardiomyopatian genetiikka

B.3. Tulokset ja vaikutukset:

On suuri kunnia, että Sir Magdy yacoub tarkisti tätä projektia useammin kuin kerran ja on suuri kunnia minulle ja koko projektin tiimille, että hän sir Magdy yaq. Hyväksyttiin tämän projektin yhteistutkijaksi, ja tämä heijastaa todella hänen isänmaallisuuttaan ja hänen huolenpitoaan kaikesta, mikä on egyptiläisten terveyden edun mukaista. Selvittää geneettisiä biomarkkereita ja allekirjoituksia, jotka ovat tyypillisiä iskeemisen kardiomyopatian ja laajentuneen kardiomyopatian potilaille prekliinisessä laitoksessa. sydämen vajaatoiminnan vaihe, sydämen vajaatoiminnan oireellinen kliininen vaihe ja dekompensoitu loppuvaiheen sydämen vajaatoiminta. Näitä spesifisiä biomarkkereita voidaan käyttää suuresti diagnostisina biomarkkereina IHD- ja DCM-potilaille, joilla on erittäin suuri riski etenemisestä myöhempään sydämen vajaatoiminnan vakavaan oireenmukaiseen vaiheeseen. Näiden potilaiden varhainen seulonta voi auttaa estämään heidän etenemisensä sydämen vajaatoiminnan myöhempään vaiheeseen tiiviin seurannan sekä terapeuttisten ja ei-terapeuttisten strategioiden avulla. Otamme huomioon, että tyypillisesti oireilevien sydämen vajaatoimintapotilaiden etenemisen hidastamiseen tai estämiseen käytettyjä perinteisiä farmakologisia aineita - pääasiassa beetasalpaajia ja angiotensiinikonvertaasin estäjiä - on jo määrätty kaikille IHD-potilaille, joiden tehoa ei ole osoitettu estämään niiden etenemistä. potilaista tyypillisiin sydämen vajaatoimintapotilaisiin (vasemman kammion toimintahäiriöpotilaat). Edellä olevan hypoteesin perusteella on olemassa suuri tarve uusille hoitomuodoille, jotka voivat estää rakenteellisten sydänsairauspotilaiden (vaiheen B sydämen vajaatoiminta) etenemisen tyypillisiksi ja loppuvaiheen sydämen vajaatoimintapotilaiksi (vaiheen C ja D sydämen vajaatoiminta).

Odotetut tulokset voivat selittää uusia geneettisiä polkuja oireettoman rakenteellisen sydänsairauden (vaiheen B sydämen vajaatoiminta) kliinisen etenemisen tyypillisesti oireenmukaiseen sydämen vajaatoimintaan (vaihe C) ja dekompensoituneeseen sydämen vajaatoimintaan (vaihe D).

Tämän projektin odotetut tulokset voivat johtaa meidät uuteen perustaan ​​ensimmäisen egyptiläisen tietokannan geneettisistä biomarkkereista eri sydämen vajaatoiminnan vaiheissa, joilla on taustalla IHD tai DCM.

Idean uutuus ja suunnitelmamme käyttää viimeisimpiä geeniekspression profilointitekniikoita ja uusimpia bioinformatiikan menetelmiä voivat pohjustaa tämän työn tulosten julkaisemista High Impact Factor -lehdessä sekä molekyyligenetiikan että kardiologian alalla.

Tämän projektin odotettu tulos voi olla referenssi monille sydämen vajaatoiminnan ja sydämen molekyyligenetiikan maisteri- ja tohtorintutkintoehdokkaille Egyptissä ja ympäri maailmaa. Ajatuksen uutuus, kun otetaan huomioon, että - suurimman osan tietämyksemme mukaan - ei ole olemassa aikaisempia tutkimuksia, joissa olisi tutkittu spesifistä geeniekspression profiloitumista sydämen vajaatoiminnan eri vaiheissa, ja se voi houkutella alan erikoistuneiden tutkijoiden viittauksia.

Oireettoman rakenteellisen sydänsairauden potilaiden varhainen seulonta, jolla on suuri riski etenevän sydämen vajaatoiminnan vaiheiden kehittymisestä, voi auttaa estämään heidän etenemisensä farmakologisilla ja ei-farmakologisilla strategioilla. Tämä voi auttaa säästämään valtavasti valtion varoja, jotka on käytetty sellaisten potilaiden hoitoon, joilla on sydämen vajaatoiminnan vakava oireinen dekompensaatiovaihe.

Tutkijoiden suunnitelmana on käyttää tässä hankkeessa paljastettavaa tietoa edelleen soveltaakseen viimeksi tutkittuja RNA-aktivaatio- ja repressiotekniikoita geenien yli-ilmentymisen ja geenihäiriöiden hoitoon potilailla, jotka kärsivät etenevän vaiheen sydämen vajaatoiminnasta VS. sydämen vajaatoiminnan primaarisissa oireettomissa vaiheissa olevat tasoittamaan tietä innovatiiviselle uudelle geeniterapialle, jolla estetään sydämen vajaatoiminnan eteneminen primaarivaiheista progressiivisiin vaiheisiin ja loppuvaiheen sydämen vajaatoimintapotilaiden toipuminen vakaaseen oireettomaan normaaliin elämäntapavaiheeseen. sairaus. Tämä uusi terapia ei ainoastaan ​​auta lievittämään näin valtavan määrän egyptiläisiä, jotka kärsivät tästä vakavasti vammauttavasta sairaudesta, vaan se on myös tieteellinen vallankumouksellinen läpimurto geeniterapian alalla kaikkialla maailmassa. Olemme täynnä uskoa siihen, että olemme egyptiläisiä, jotka voivat tehdä ihmeitä kärsivällisyydellä, päättäväisyydellä, taistelulla ja uskolla unelmaan.

B.4. Uusinta tekniikkaa ja huippuosaamista:

Sydämen vajaatoiminta (HF) vaivaa arviolta 6,5 ​​miljoonaa aikuista amerikkalaista [1]. Vaikka eloonjäämisluvut ovat nousseet 10 % vuosina 1979–2000, nykyinen viiden vuoden kuolleisuusaste on edelleen noin 50 % [1, 2]. Pitkäaikainen paradigma on, että loppuvaiheen sydämen vajaatoiminta, jossa on vähentynyt ejektiofraktio (HFrEF), kehittyy "lopullisen yhteisen reitin" kautta huolimatta siitä, että sillä on monia erilaisia ​​etiologioita ja geneettisiä vaikutuksia [3, 4]. Kliiniset tutkimustulokset ja nykyiset HFrEF:n hallintaohjeet vahvistavat tämän näkemyksen ja suoran hoidon, joka perustuu pääasiassa vasemman kammion ejektiofraktion asteeseen ja kliinisen vaikeusasteeseen käyttäen New York Heart Associationin (NYHA) luokittelua [5].

Iskeeminen sydänsairaus (IHD) on yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti WHO:n raporttien mukaan ja johtava sydämen vajaatoiminnan syy kehittyneissä maissa [6-9]. IHD:n sekundaarisen sydämen vajaatoiminnan on havaittu liittyvän itsenäisesti korkeampaan kuolleisuuteen verrattuna ei-iskeemiseen etiologiaan [10, 11]. Lisääntyvän ilmaantuvuuden on katsottu johtuvan trombolyyttisen ja primaarisen perkutaanisen sepelvaltimointervention korkeasta tehokkuudesta akuuttien sydäninfarktien hoidossa, mikä parantaa potilaiden eloonjäämistä, mutta johtaa kuitenkin usein lisääntyneeseen sairastumiseen vasemman kammion (LV) uudelleenmuodostumisen ja kroonisen vasemman kammion vuoksi. toimintahäiriö. Termi iskeeminen kardiomyopatia (ICM) on määritelty LV:n systoliseksi toimintahäiriöksi, jolla on yksi tai useampi seuraavista: aiempi sydänlihaksen revaskularisaatio tai sydäninfarkti, yli 75 % ahtauma vasemmassa päävarressa tai vasemmassa laskeutuvassa etuvaltimossa tai kaksi verisuonet tai enemmän, joiden ahtauma on yli 75 % [12].

Yksi yleisimmistä sydämen vajaatoiminnan syistä on kardiomyopatiat. American Heart Association kuvasi kardiomyopatiat heterogeeniseksi ryhmäksi sydänlihassairauksia, jotka ovat pääasiassa geneettisiä ja liittyvät mekaaniseen ja/tai sähköiseen toimintahäiriöön [13]. DCM:lle on tunnusomaista vasemman kammion tai kaksikammiolaajeneminen ja systolinen toimintahäiriö epänormaalien kuormitusolosuhteiden puuttuessa. Se on toiseksi yleisin sydämen vajaatoiminnan syy, jonka ejektiofraktio on pienentynyt. DCM on monimutkainen sairaus, jossa on erilaisia ​​geneettisiä muunnelmia ja ympäristötekijöitä, jotka määräävät taudin alkamisen ja taudin kulun [14, 15].

IHD ja kardiomyopatiat muuttavat sydänlihaksen rakennetta ja voivat johtaa sydämen toiminnan muutoksiin [16] mukaan lukien vasemman kammion ejektiofraktion (LVEF) väheneminen. Potilaiden tunnistaminen "sydämen vajaatoimintaa edeltävässä" vaiheessa voi estää HF:n kehittymisen soveltamalla mukautettuja lääketieteellisiä ja ei-lääketieteellisiä strategioita. Tätä hiljaista prekliinistä tilaa (pre-sydämen vajaatoimintaa) kutsutaan oireettomaksi vasemman kammion toimintahäiriöksi (ALVD), ja se voidaan erottaa vain transthorakaalisella kaikukardiografialla. ALVD, joka on yleinen väestössä, johtaa suureen riskiin saada ilmeinen HF. Itse asiassa ALVD-potilailla on 12-kertainen vuotuinen sairaalahoitomäärä ensimmäisen tapahtuman HF:n vuoksi verrattuna henkilöihin, joilla on normaali LVEF [17], ja 4-kertainen kuolemanriski kuuden vuoden aikana [16]. . Tehokas laajamittainen ALVD-seulonta, joka edustaa suurta täyttämätöntä kliinistä haastetta, edellyttää ALVD-biomarkkerien määrittämistä.

ALVD:n seulonta on aloitettu yli vuosikymmenen ajan [17], [18]. ALVD-biomarkkereita ei kuitenkaan ole. Itse asiassa ALVD-diagnoosi vaatii monimutkaisen kaikukardiografisen analyysin, joka on aikaa vievää, kallista eikä sovellu suurelle riskiryhmälle. Biomarkkerien puute voi olla erittäin tärkeä, koska ALVD on erittäin yleistä kardiovaskulaaristen riskitekijöiden yleisen lisääntymisen vuoksi [19]. ALVD:n on todettu olevan vaikean HF:n ennakoiva varhainen indikaattori [20]. Seurantatutkimukset ovat osoittaneet, että ALVD-potilaiden keskimääräinen vuotuinen krooninen sydämen vajaatoiminta on 4,9-20 % ja kuolleisuus 5,1-10,5 % [21], [22]. Nämä havainnot vahvistettiin äskettäin viiden vuoden eloonjäämisprosenttianalyysissä, joka osoitti 31 %:n kuolleisuuden ALVD-potilailla ja 47 %:lla potilailla, joilla oli systolinen HF [23]. Lopuksi SOLVD-tutkimus osoitti, että ALVD:n hoito voi viivästyttää merkittävästi HF:n esiintymistä [24]. Siksi voi olla äärimmäisen kliinistä merkitystä tunnistaa ALVD-henkilöt yleisestä populaatiosta ennen kuin heille kehittyy selvä HF.

On vain vähän tutkimuksia, joissa on tutkittu geneettisiä biomarkkereita, jotka ovat spesifisiä iskeemisen sydänsairauden (IHD) potilaille (joilla on tai ei ole aiemmin ollut akuutti sydäninfarkti) tai DCM-potilaita, joilla oli normaali vasemman kammion toiminta (vaihe B), IHD- tai DCM-potilaille tyypillinen oireinen sydämen vajaatoiminta (vaihe C) ja IHD- tai DCM-potilaat, jotka etenevät dekompensoituneeseen sydämen vajaatoimintaan (vaihe D). Maciejak ym. [25] tutkivat akuutin sydäninfarktin (AMI) sairastavien IHD-potilaiden geneettisiä biomarkkereita, joille kehittyi vasemman kammion toimintahäiriö VS. akuuttia sydäninfarktipotilaita, jotka säilyttävät normaalin kammioiden ejektiofraktion samaan aikaan. He osoittivat muuttuneen geeniekspressioprofiilin AMI:ssä, jolle kehittyi HF. Sweet ym. [26] analysoivat koko transkription iskeemisestä kardiomyopatiasta (ICM) ja DCM-potilaista verrattuna terveisiin potilaisiin, joilla ei ole ollut sydän- ja verisuonisairauksia. He löysivät keskeisiä etiologiakohtaisia ​​allekirjoituksia, jotka olivat tyypillisiä ICM:lle ja DCM:lle. Tijsen ym. [27] suorittivat mikro-RNA-sarjan terveille koehenkilöille, sydämen vajaatoimintapotilaille, potilaille, joilla oli sydämen vajaatoiminnasta johtuva hengenahdistus ja potilaille, joilla oli hengenahdistus muista syistä kuin sydämen vajaatoiminnasta. He tunnistivat 6 miRNA:ta, jotka ovat kohonneita HF-potilailla, joista miR423-5p liittyi vahvimmin HF:n kliiniseen diagnoosiin. Smih F et ai. [28] tutkivat microarray-analyysillä spesifistä geeniekspressioprofiilia oireettomille vasemman kammion toimintahäiriöille, nimittäin potilaille, jotka sairastavat sydämen vajaatoimintaa. Mikään edellä mainituista kokeista ei tutkinut geenien ilmentymisprofiileja tai geneettisiä biomarkkereiden allekirjoituksia, jotka ovat spesifisiä sydämen vajaatoiminnan VS:n eteneville oireille. prekliininen sydämen vajaatoimintavaihe.

Aiemmat microarray-tutkimukset paljastivat selkeitä geeniekspression allekirjoituksia HF-etiologioiden välillä [28-33]; mutta toiset eivät löytäneet eroja [34, 35]. Suora RNA-sekvensointi (RNA-seq) tarjoaa myös tarkan transkriptien kvantifioinnin, ja sitä on käytetty tunnistamaan ilmentymisen allekirjoitukset HF:n ja NF-sydämien välillä [36], uudet transkription säätelijät ja häiriintyneet miRNA-verkot ICM:ssä tai DCM:ssä [37]. , 38], pre- ja post-LVAD-transkriptomit [39, 40], yleiset HF-geenit lasten kardiomyopatiassa [41] ja silmukointi, eQTL ja alleelinen ilmentyminen DCM:ssä [42].

Oletamme, että spesifisten geneettisten muunnelmien, kuten geenien yli-ilmentymisen tai geenin epäsäännöllisyyden, täydellinen ymmärtäminen sellaisissa IHD- tai DCM-potilasryhmissä, jotka etenevät sydämen vajaatoiminnan myöhempään vaiheeseen VS. IHD- tai DCM-potilaat, jotka säilyttävät normaalin systolisen toiminnan, voivat valmistaa tietä diagnostisten geneettisten biomarkkereiden selvittämiselle IHD-potilailla ja DCM-potilailla, joilla on suuri riski eteneä sydämen vajaatoiminnan myöhempään vaiheeseen. Lisäksi erilaisten geenien ilmentymisprofiilien selvittäminen IHD- ja DCM-potilailla sydämen vajaatoiminnan eri vaiheissa voi olla ensimmäinen askel uusien geenihoitojen kehittämisessä sydämen vajaatoiminnan etenemisen ehkäisemiseksi IHD-potilailla B-vaiheessa ja IHD-potilaiden toipumisessa. sydämen vajaatoiminnan etenevät vaiheet (C ja D).

B.7. Lähestymistapa ja menetelmät:

1. Projektinhallinta ja konsortio

2. Potilaiden rekrytointi ja jakaminen Asyutin yliopiston koulutuskardiologian sairaalan institutionaalinen arviointilautakunta suunnittelee ja tarkastaa laajasti tämän tutkimuksen protokollan. Kaikkia potilaita pyydetään allekirjoittamaan yksityiskohtainen tietoinen suostumus ennen rekrytointia.

   Osallistumiskriteerit: IHD- tai DCM-potilaat, joilla ei ole HF-oireita (vaihe B), joilla on tyypillisiä HF-oireita (vaihe C) ja potilaat, joilla on dekompensoitunut HF (vaihe D).

   Poissulkemiskriteerit: Potilaat, joilla on muita rakenteellisia sydänsairauksia kuin IHD tai DCM.

   Tässä tutkimuksessa rekrytoidaan IHD-potilaita tai DCM-potilaita, joita seurataan Assyutin yliopiston kardiologisessa sairaalassa.

   Kaikille palvelukseen otetuille potilaille suoritetaan täydelliset laboratoriotutkimukset ja täydelliset fyysiset tarkastukset vähintään kahden kardiologin toimesta sairaalassa. Kaikille potilaille tehdään kaikukardiografinen tutkimus rakenteellisen sydänsairauden havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi sekä ejektiofraktion tarkka mittaus sydämen vajaatoiminnan asteittausta varten.

   Rekrytoidut potilaat jaetaan johonkin tutkimusryhmään sydämen vajaatoiminnan nykyisen kliinisen vaiheen mukaan.

   Ryhmä A: IHD-potilaat, joilla ei ole kliinisiä sydämen vajaatoiminnan oireita ja normaali vasemman kammion systolinen toiminta (prekliinisen vaiheen tai vaiheen B sydämen vajaatoiminta) Ryhmä B: IHD-potilaat, joilla on tyypillisiä sydämen vajaatoiminnan kliinisiä oireita sekä vähentynyt ejektiofraktio < 35 % ( C-vaiheen sydämen vajaatoiminta) Ryhmä C: IHD-potilaat, joilla on dekompensoitunut sydämen vajaatoiminta (vaiheen D sydämen vajaatoiminta) Ryhmä D: DCM-potilaat, joilla ei ole sydämen vajaatoiminnan kliinisiä oireita ja joilla on normaali vasemman kammion systolinen toiminta (prekliinisen vaiheen tai vaiheen B sydämen vajaatoiminta) Ryhmä E: DCM-potilaat, joilla on tyypillisiä sydämen vajaatoiminnan kliinisiä oireita sekä vähentynyt ejektiofraktio < 35 % (vaiheen C sydämen vajaatoiminta) Ryhmä F: DCM-potilaat, joilla on dekompensoitunut sydämen vajaatoiminta (vaiheen D sydämen vajaatoiminta)

   Potilaita rekrytoidaan Assyutin yliopiston opetuskardiologian sairaalan ulkopuolisilta kardiologian klinikoilta, sisäisen kardiologian osastolta ja tehohoitoyksiköltä.

   Otoskoon laskenta Laskemme IHD-potilaiden otoskoon kuvailevan tutkimussuunnitelman otoskoon yhtälön mukaisesti (43) perustuen sepelvaltimotautien kokonaisprevalenssiin 6,7 % yhdysvaltalaisilla ≥ 20-vuotiailla aikuisilla ja DCM:n esiintyvyydellä. on 5-8 per 100 000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= otoksen koko Z1-α/2= edustaa standardivirheiden lukumäärää keskiarvosta (vakio = 1,96) P= Edustaa parhaan arvauksen osuutta kiinnostavan osuuden arvosta. = yleisyys D = absoluuttinen tarkkuus, joka vaaditaan osuuden tai etäisyyden kummaltakin puolelta; kuinka lähellä kiinnostuksen osuutta arvion halutaan olevan. 0,05.

   IHD-potilaiden otoskoko, joka perustuu esiintyvyysasteeseen 0,067, on 96 potilasta.

   DCM-potilaille vaadittava otoskoko, joka perustuu esiintyvyysasteeseen 0,008, on 11 potilasta. Otoskoko (mukaan lukien kontrollikohteet) on 107 potilasta.

3. Sydämen biopsia

   Bioptomia käytetään kammiokudoksen erottamiseen (biopsia). Poimitut näytteet varastoidaan nestetyppeen -80 celsiusasteessa.

4. Sarjat, kemikaalit ja kulutustarvikkeet maahantuonti
5. RNA:n eristäminen Kokonais-RNA uutetaan kudosnäytteistä potilailta, joilla on eri kliinisen sydämen vajaatoiminnan vaiheita ja terveitä ihmisiä käyttäen Tempus TM spin RNA Isolation Kit -sarjaa Tempus TM Blood RNA -putkessa valmistajan ohjeiden mukaisesti (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (Liite A)

7- RNA-sekvensointi

(Thermofisher Ion Torrent -alusta): vaihtoehto A

Todella täydellinen transkriptieristys seuraavan sukupolven sekvensointianalyysiä varten tuotetaan käyttämällä The RiboMinus™ Eukaryote System v2:ta (Liite C). Ion Total RNA-Seq Kit v2:ta käytetään yksinkertaiseen RNA-kirjaston rakentamiseen (Liite D). Ion Chef -järjestelmää käytetään poistettavien mallien valmisteluun ja lastujen lataamiseen (Liite E). Ion GeneStudio S5 -järjestelmiä hyödynnetään geenipaneelien sekvensoinnissa aina transkriptiin asti (Liite F). Torrent Suite -ohjelmisto tarjoaa automaattisesti sekvenssilukemat vietävissä FASTQ- tai BAM-muodoissa (Liite G).

8- Bioinformatiikka ja data-analyysi

Torrent Suite Software "RNASeqAnalysis" Plugin -laajennusta käytetään alustavaan analyysiin, mukaan lukien RNA-transkriptien kohdistaminen ja kvantifiointi. Käytämme hg19:ää ihmisen referenssigenomina, jossa täydelliset ja osittaiset kohdistukset havaitaan käyttämällä sekä STAR- että Bowtie2-kartoittimia. Picard-työkaluja käytetään jokaiseen geeniin kohdistettujen lukujen laskemiseen, kun taas kalvosinnapit-ohjelmistoa käytetään edustamaan kunkin geenin eri isoformeja. Yksittäisille näytteille luodaan kattavat käyrät sekä näytteitä vertailevat käyrät. Jatkossa spesifinen analyysi suoritetaan käyttämällä talon sisällä kehitettyjä skriptejä (pythonissa tai R:ssä) laskosten muutosten laskemiseen, ylös- ja alassäädeltyjen geenien/isoformien tunnistamiseen ja polun rikastusanalyysiin Cytoscape-ohjelmistolla. Reitin rikastusanalyysillä voidaan tunnistaa reittejä, joilla voi olla roolia taudissa aikasarjatiedoista. Käytämme integroivaa Multi-Omics-lähestymistapaa molemmista datatyypeistä (RNA-Seq) saatujen tietojen integroimiseksi ja korreloimiseksi.

9- käsikirjoitus ja julkaisu

Odotamme tämän projektin julkaisemisen tuloksena vähintään kahdessa korkean vaikutustekijän julkaisussa molekyyligenetiikan ja kardiologian alalla.

B.8. Pätevyydet ja pätevyydet (max 2 sivua):

Tärkein pätevyys on ammattitaitoisten kardiologien ja molekyyligeneettisten asiantuntijoiden saatavuus, jotka pystyvät suorittamaan tutkimuksen ripeästi. Lisäksi erittäin kalliita perustavanlaatuisia kriittisiä instrumentteja, joita tarvitaan sekä microarray-geeniekspression profilointiin että koko transkription ionitorrentin RNA-sekvensointiin, on saatavilla kansallisen tutkimuskeskuksen, Magdy Yaacoub -säätiön ja monien muiden yksityisten molekyylilaboratorioiden molekyylilaboratorioissa Egyptissä.

Tärkeimmät osaamiset ovat sarjojen, kemikaalien, kulutustarvikkeiden ja joidenkin pienten instrumenttien korkeat kustannukset, jotka tulisi ostaa projektin täydelliseen toteuttamiseen.