Genetyka kardiomiopatii niedokrwiennej

B.3. Wyniki i wpływ:

To wielki zaszczyt, że sir Magdy yacoub poprawiał ten projekt więcej niż raz, a dla mnie i całego zespołu projektowego to wielki zaszczyt, że sir Magdy yaq. Został zaakceptowany jako współbadacz tego projektu, co naprawdę odzwierciedla jego patriotyzm i troskę o wszystko, co leży w interesie zdrowia Egipcjan. Znalezienie genetycznych biomarkerów i sygnatur, które charakteryzują pacjentów z kardiomiopatią niedokrwienną i kardiomiopatią rozstrzeniową na oddziale przedklinicznym stadium niewydolności serca, objawowym stadium klinicznym niewydolności serca i zdekompensowanej schyłkowej niewydolności serca. Te specyficzne biomarkery mogą być szeroko stosowane jako biomarkery diagnostyczne dla pacjentów z IHD i DCM z bardzo wysokim ryzykiem progresji do późniejszych ciężkich stadiów niewydolności serca. Wczesne badanie przesiewowe tych pacjentów może pomóc w zapobieganiu progresji do późniejszych stadiów niewydolności serca poprzez ścisłe monitorowanie oraz strategie terapeutyczne i pozaterapeutyczne. Wzięliśmy pod uwagę, że tradycyjne środki farmakologiczne stosowane w celu spowolnienia lub zapobiegania postępowi typowo objawowej niewydolności serca – głównie beta-adrenolityki i inhibitory konwertazy angiotensyny – są już przepisywane wszystkim pacjentom z IHD bez udowodnionej skuteczności w zapobieganiu postępowi tych chorób. pacjentów z typową niewydolnością serca (pacjenci z dysfunkcją lewej komory). W oparciu o powyższą hipotezę istnieje duże zapotrzebowanie na nowe terapie, które mogą zapobiegać progresji pacjentów z strukturalną chorobą serca (niewydolność serca w stadium B) do pacjentów z typową i schyłkową niewydolnością serca (niewydolność serca w stadium C i D).

Oczekiwane wyniki mogą wyjaśnić nowe ścieżki genetyczne klinicznej progresji bezobjawowej strukturalnej choroby serca (stadium B niewydolności serca) do typowo objawowej niewydolności serca (stadium C) i zdekompensowanej niewydolności serca (stadium D).

Oczekiwane wyniki tego projektu mogą doprowadzić nas do stworzenia nowatorskiej podstawy pierwszej egipskiej bazy danych biomarkerów genetycznych różnych stadiów niewydolności serca z leżącą u podstaw IHD lub DCM.

Nowatorski pomysł i nasz plan wykorzystania najnowszych technik profilowania ekspresji genów i najbardziej aktualnych metodologii bioinformatycznych mogą utorować drogę do opublikowania wyników tej pracy w czasopiśmie o wysokim współczynniku wpływu, zarówno w dziedzinie genetyki molekularnej, jak i kardiologii.

Oczekiwany rezultat tego projektu może być punktem odniesienia dla wielu kandydatów na stopnie magisterskie i doktoranckie z zakresu niewydolności serca i genetyki molekularnej serca w Egipcie i na świecie. Nowatorski pomysł, zważywszy, że - według większości naszej wiedzy - nie ma wcześniejszych badań, które badałyby specyficzne profilowanie ekspresji genów w różnych stadiach niewydolności serca, może przyciągnąć wysoką liczbę cytowań przez wyspecjalizowanych naukowców w tej dziedzinie.

Wczesne badanie przesiewowe pacjentów z bezobjawową strukturalną chorobą serca, u których występuje duże ryzyko rozwoju postępujących stadiów niewydolności serca, może pomóc w zapobieganiu ich progresji za pomocą strategii farmakologicznych i niefarmakologicznych. Może to przyczynić się do zaoszczędzenia ogromnych pieniędzy rządowych wydawanych na opiekę i leczenie tych pacjentów w ciężkich objawach zdekompensowanych stadiach niewydolności serca.

Naukowcy planują dalsze wykorzystanie informacji, które zostaną ujawnione w ramach tego projektu, w celu zastosowania ostatnio zbadanych technik aktywacji i represji RNA w leczeniu nadekspresji genów i dysregulacji genów u pacjentów cierpiących na postępujące stadia niewydolności serca VS. osób w pierwotnych bezobjawowych stadiach niewydolności serca, aby utorować drogę dla innowacyjnej, nowej terapii genowej w celu zapobiegania progresji od pierwotnych do progresywnych stadiów niewydolności serca oraz powrotu pacjentów ze schyłkową niewydolnością serca do stabilnych, bezobjawowych, normalnych etapów stylu życia choroba. Ta nowatorska terapia nie tylko przyczyni się do złagodzenia nędzy tak ogromnej liczby Egipcjan cierpiących na tę wielce upośledzającą chorobę, ale także będzie naukowym rewolucyjnym przełomem w dziedzinie terapii genowej na całym świecie. Jesteśmy pełni wiary, że jesteśmy Egipcjanami, dzięki cierpliwości, determinacji, walce i wierze w nasze marzenia.

B.4. Nowoczesność i doskonałość:

Niewydolność serca (HF) dotyka około 6,5 miliona dorosłych Amerykanów [1]. Chociaż wskaźniki przeżywalności wzrosły o 10% w latach 1979-2000, obecna śmiertelność 5-letnia nadal wynosi około 50% [1, 2]. Długoletni paradygmat głosi, że schyłkowa niewydolność serca ze zmniejszoną frakcją wyrzutową (HFrEF) ewoluuje poprzez „ostateczną wspólną ścieżkę”, pomimo wielu różnych etiologii i wkładu genetycznego [3, 4]. Wyniki badań klinicznych i aktualne wytyczne postępowania w HFrEF potwierdzają ten punkt widzenia i kierują terapię opartą głównie na stopniu frakcji wyrzutowej lewej komory oraz ciężkości klinicznej według klasyfikacji New York Heart Association (NYHA) [5].

Według raportów WHO choroba niedokrwienna serca (ChNS) jest najczęstszą przyczyną zgonów na świecie i główną przyczyną niewydolności serca w krajach rozwiniętych [6-9]. Stwierdzono, że niewydolność serca wtórna do IHD jest niezależnie związana z wyższą śmiertelnością w porównaniu z etiologią inną niż niedokrwienna [10, 11]. Wzrastającą zapadalność przypisuje się wysokiej skuteczności trombolitycznej i pierwotnej przezskórnej interwencji wieńcowej w leczeniu ostrych zawałów mięśnia sercowego, co prowadzi do poprawy przeżywalności pacjentów, jednak często prowadzi do zwiększonej chorobowości z powodu przebudowy lewej komory (LV) i przewlekłej lewej komory dysfunkcja. Termin kardiomiopatia niedokrwienna (ICM) został zdefiniowany jako dysfunkcja skurczowa lewej komory z jednym lub kilkoma z następujących objawów: przebyta rewaskularyzacja mięśnia sercowego lub zawał mięśnia sercowego w wywiadzie, ponad 75% zwężenie pnia głównego lub lewej tętnicy zstępującej przedniej lub dwa naczyń lub więcej ze zwężeniem większym niż 75% [12].

Jedną z najczęstszych przyczyn niewydolności serca są kardiomiopatie. American Heart Association określiło kardiomiopatie jako heterogenną grupę chorób mięśnia sercowego, które mają głównie podłoże genetyczne i są związane z dysfunkcjami mechanicznymi i/lub elektrycznymi [13]. DCM charakteryzuje się obecnością rozstrzeni lewej lub dwukomorowej oraz dysfunkcją skurczową przy braku nieprawidłowych warunków obciążenia. Jest drugą najczęstszą przyczyną niewydolności serca z obniżoną frakcją wyrzutową. DCM jest złożonym schorzeniem o zróżnicowanych wariantach genetycznych i czynnikach środowiskowych, które determinują początek i przebieg choroby [14, 15].

IHD i kardiomiopatie powodują modyfikację struktury mięśnia sercowego i mogą prowadzić do zmian funkcji serca [16], w tym do zmniejszenia frakcji wyrzutowej lewej komory (LVEF). Identyfikacja pacjentów na etapie „niewydolności serca” może zapobiegać rozwojowi HF poprzez wdrożenie dostosowanych strategii medycznych i pozamedycznych. Ten cichy stan przedkliniczny (niewydolność przedsercowa) jest określany jako bezobjawowa dysfunkcja lewej komory (ALVD) i może być rozróżniony jedynie za pomocą echokardiografii przezklatkowej. Częsta w populacji ogólnej ALVD wiąże się z dużym ryzykiem rozwoju jawnej HF. Rzeczywiście, pacjenci z ALVD mają 12-krotny wzrost rocznego wskaźnika hospitalizacji z powodu pierwszego zdarzenia HF w porównaniu z osobami z prawidłową LVEF [17] i 4-krotny wzrost ryzyka zgonu w okresie 6 lat [16] . Skuteczne badania przesiewowe na dużą skalę w kierunku ALVD, stanowiące główne niespełnione wyzwanie kliniczne, wymagają określenia biomarkerów ALVD.

Badania przesiewowe w kierunku ALVD rozpoczęto od ponad dekady [17], [18]. Jednak nie ma biomarkerów ALVD. Rzeczywiście, diagnoza ALVD uzasadnia skomplikowaną analizę echokardiograficzną, która jest czasochłonna, kosztowna i nie ma zastosowania do dużej populacji osób z grupy ryzyka. Brak biomarkera(ów) może mieć duże znaczenie, ponieważ ALVD występuje bardzo często ze względu na ogólny wzrost czynników ryzyka sercowo-naczyniowego [19]. ALVD została uznana za wczesny wskaźnik predykcyjny ciężkiej HF [20]. Dalsze badania wykazały, że u pacjentów z ALVD średni roczny wskaźnik przewlekłej niewydolności serca wynosi od 4,9 do 20%, a śmiertelność wynosi od 5,1 do 10,5% [21], [22]. Obserwacje te zostały niedawno potwierdzone w analizie 5-letnich przeżyć, która wykazała śmiertelność 31% wśród osób z ALVD i 47% wśród pacjentów ze skurczową HF [23]. Wreszcie badanie SOLVD wykazało, że leczenie ALVD może znacznie opóźnić wystąpienie HF [24]. Dlatego też może mieć ogromne znaczenie kliniczne zidentyfikowanie osób z ALVD w populacji ogólnej, zanim rozwinie się u nich jawna HF.

Istnieje niewiele badań, w których badano biomarkery genetyczne specyficzne dla pacjentów z chorobą niedokrwienną serca (ChNS) (z lub bez ostrego zawału mięśnia sercowego w wywiadzie) lub pacjentów z DCM, którzy utrzymali prawidłową czynność lewej komory (stadium B), pacjentów z IHD lub DCM z typową objawową niewydolnością serca (stadium C) oraz u pacjentów z IHD lub DCM, u których dochodzi do dekompensacji niewydolności serca (stadium D). Maciejak i wsp. [25] badali biomarkery genetyczne pacjentów z IHD z ostrym zawałem mięśnia sercowego (AMI), u których rozwinęła się dysfunkcja lewej komory VS. pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego, którzy zachowali prawidłową frakcję wyrzutową komór w tym samym czasie. Wykazali zmieniony profil ekspresji genów w AMI, u którego rozwinęła się HF. Sweet i wsp. [26] przeanalizowali cały transkryptom u pacjentów z kardiomiopatią niedokrwienną (ICM) i pacjentów z DCM w porównaniu ze zdrowymi pacjentami bez chorób sercowo-naczyniowych w wywiadzie. Znaleźli kluczowe sygnatury specyficzne dla etiologii, które charakteryzowały ICM i DCM. Tijsen i wsp. [27] wykonali mikromacierze RNA u osób zdrowych, pacjentów z niewydolnością serca, pacjentów z dusznością spowodowaną niewydolnością serca oraz pacjentów z dusznością z przyczyn innych niż niewydolność serca. Zidentyfikowali 6 miRNA, które są podwyższone u pacjentów z HF, wśród których miR423-5p był najsilniej powiązany z kliniczną diagnozą HF. Smih F. i wsp. [28] zbadali, za pomocą analizy mikromacierzy, specyficzny profil ekspresji genów dla bezobjawowej dysfunkcji lewej komory, mianowicie u pacjentów ze stanem przed niewydolnością serca. W żadnym z wyżej wymienionych badań nie oceniano profili ekspresji genów ani sygnatur biomarkerów genetycznych swoistych dla postępujących, objawowych stadiów VS niewydolności serca. stadium przedklinicznej niewydolności serca.

Wcześniejsze badania mikromacierzy ujawniły różne sygnatury ekspresji genów pomiędzy etiologiami HF [28-33]; ale innym nie udało się znaleźć rozróżnienia [34, 35]. Bezpośrednie sekwencjonowanie RNA (RNA-seq) zapewnia również dokładną kwantyfikację transkryptów i zostało wykorzystane do identyfikacji sygnatur ekspresji między sercami z HF a sercami sprawnymi (NF) [36], nowymi regulatorami transkrypcji i zaburzonymi sieciami miRNA w ICM lub DCM [37 , 38], transkryptomy przed i po LVAD [39, 40], wspólne geny HF w kardiomiopatii dziecięcej [41] oraz splicing, eQTL i ekspresja alleliczna w DCM [42].

Stawiamy hipotezę, że pełne zrozumienie specyficznych zmienności genetycznych, takich jak nadekspresja genów lub dysregulacja genów w takich kohortach pacjentów z IHD lub DCM, którzy przechodzą do późniejszych stadiów niewydolności serca VS. Pacjenci z IHD lub DCM, którzy zachowują prawidłową czynność skurczową, mogą utorować drogę do znalezienia diagnostycznych biomarkerów genetycznych pacjentów z IHD i DCM z wysokim ryzykiem progresji do późniejszych stadiów niewydolności serca. Co więcej, poznanie zróżnicowanych profili ekspresji genów u pacjentów z IHD i DCM w różnych stadiach niewydolności serca może być pierwszym krokiem do innowacji w zakresie nowych terapii genowych w celu zapobiegania progresji niewydolności serca u pacjentów z IHD w stadium B i powrotu do zdrowia pacjentów z IHD w stadium B. postępujące stadia niewydolności serca (C i D).

B.7. Podejście i metodologia:

1. Zarządzanie projektami i konsorcjum

2. Rekrutacja i przydział pacjentów Protokół tego badania zostanie szeroko zaprojektowany i zweryfikowany przez instytucjonalną komisję rewizyjną edukacyjnego szpitala kardiologicznego Uniwersytetu Asyut. Przed rekrutacją wszyscy pacjenci zostaną poproszeni o podpisanie szczegółowej świadomej zgody.

   Kryteria włączenia: pacjenci z IHD lub DCM bez objawów HF (stopień B), z typowymi objawami HF (stopień C) oraz pacjenci ze zdekompensowaną HF (stopień D).

   Kryteria wykluczenia: Pacjenci ze strukturalnymi chorobami serca innymi niż IHD lub DCM.

   Pacjenci z IHD lub pacjenci z DCM obserwowani w edukacyjnym szpitalu kardiologicznym Uniwersytetu Assyut będą rekrutowani do tego badania.

   Wszyscy zrekrutowani pacjenci przejdą pełne badania laboratoryjne i pełne badanie fizykalne przez co najmniej dwóch kardiologów w szpitalu. Wszyscy pacjenci zostaną poddani badaniu echokardiograficznemu w celu wykrycia i potwierdzenia strukturalnej choroby serca oraz dokładnego pomiaru frakcji wyrzutowej w celu określenia stopnia zaawansowania niewydolności serca.

   Zrekrutowani pacjenci zostaną przydzieleni do jednej z grup badawczych zgodnie z aktualnym stopniem zaawansowania klinicznego niewydolności serca.

   Grupa A: Pacjenci z ChNS bez klinicznych objawów niewydolności serca i prawidłową czynnością skurczową lewej komory (niewydolność serca w stadium przedklinicznym lub B) Grupa B: Pacjenci z ChNS z typowymi objawami klinicznymi niewydolności serca wraz ze zmniejszoną frakcją wyrzutową < 35% ( niewydolność serca w stadium C) Grupa C: Pacjenci z IHD ze zdekompensowaną niewydolnością serca (niewydolność serca w stadium D) Grupa D: Pacjenci z DCM bez klinicznych objawów niewydolności serca i prawidłową czynnością skurczową lewej komory (niewydolność serca w stadium przedklinicznym lub w stadium B) Grupa E: Pacjenci z DCM z typowymi objawami klinicznymi niewydolności serca wraz ze zmniejszoną frakcją wyrzutową < 35% (niewydolność serca w stadium C) Grupa F: Pacjenci z DCM z niewyrównaną niewydolnością serca (niewydolność serca w stadium D)

   Pacjenci będą rekrutowani z zewnętrznych klinik kardiologicznych, oddziału kardiologii wewnętrznej i oddziału intensywnej opieki kardiologicznej Szpitala Kardiologicznego Uniwersytetu Assyut.

   Obliczanie wielkości próby Liczebność próby pacjentów z chorobą niedokrwienną serca obliczamy zgodnie z równaniem dla wielkości próby w projekcie badania opisowego (43) na podstawie częstości występowania całkowitej CHD wynoszącej 6,7% u dorosłych w wieku ≥ 20 lat w USA oraz częstości występowania DCM wynosi 5-8 na 100 000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Wielkość próby Z1-α/2= Reprezentuje liczbę błędów standardowych od średniej ( stała = 1,96) P = Reprezentuje proporcję najlepszego przypuszczenia co do wartości proporcji będącej przedmiotem zainteresowania. = rozpowszechnienie D = bezwzględna precyzja wymagana po obu stronach proporcji lub odległości; jak blisko części zainteresowania ma być oszacowanie. 0,05.

   Wielkość próby wymagana dla pacjentów z IHD w oparciu o częstość występowania 0,067 wyniesie 96 pacjentów.

   Wielkość próby wymagana dla pacjentów z DCM w oparciu o częstość występowania 0,008 będzie wynosić 11 pacjentów. Całkowita wielkość próby (w tym osoby kontrolne) wynosi 107 pacjentów.

3. Biopsja serca

   Bioptom będzie służył do ekstrakcji tkanki komorowej (biopsji). Wyekstrahowane okazy będą przechowywane w ciekłym azocie w temperaturze -80 stopni Celsjusza.

4. Import zestawów, chemii i materiałów eksploatacyjnych
5. Ekstrakcja RNA Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany z próbek tkanek pacjentów z różnymi stadiami klinicznej niewydolności serca oraz osób zdrowych przy użyciu zestawu do izolacji RNA Tempus TM spin w probówce Tempus TM Blood RNA, zgodnie z instrukcją producenta (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (Dodatek A)

7- Sekwencjonowanie RNA

(platforma Thermofisher Ion Torrent): opcja A

Prawdziwie kompletna izolacja transkryptomu do analizy sekwencjonowania nowej generacji zostanie przeprowadzona przy użyciu RiboMinus™ Eukaryote System v2 (Załącznik C). Zestaw Ion Total RNA-Seq Kit v2 będzie używany do prostej konstrukcji biblioteki RNA (Załącznik D). System Ion Chef będzie używany do przygotowywania szablonów i wkładania chipów (Załącznik E). Systemy Ion GeneStudio S5 zostaną wykorzystane do sekwencjonowania paneli genów aż do transkryptomu (Dodatek F). Oprogramowanie Torrent Suite automatycznie dostarcza odczyty sekwencji w eksportowalnych formatach FASTQ lub BAM (Dodatek G).

8- Bioinformatyka i analiza danych

Wtyczka „RNASeqAnalysis” oprogramowania Torrent Suite zostanie wykorzystana do wstępnej analizy, w tym wyrównania transkryptu RNA i oceny ilościowej. Użyjemy hg19 jako ludzkiego genomu referencyjnego, w którym pełne i częściowe dopasowania zostaną wykryte przy użyciu maperów STAR i Bowtie2. Narzędzia Picarda zostaną zastosowane do zliczania odczytów dopasowanych do każdego genu, podczas gdy oprogramowanie spinek do mankietów zostanie użyte do przedstawienia różnych izoform dla każdego genu. Dla poszczególnych próbek zostaną wygenerowane wykresy kompleksowe, jak również wykresy porównujące próbki. Dalsza szczegółowa analiza zostanie przeprowadzona przy użyciu opracowanych wewnętrznie skryptów (w pythonie lub R) do obliczania zmiany krotności, identyfikacji genów/izoform regulowanych w górę iw dół oraz analizy wzbogacenia szlaku przy użyciu oprogramowania Cytoscape. Analiza wzbogacenia szlaków może zidentyfikować szlaki, które mogą odgrywać rolę w chorobie na podstawie danych szeregów czasowych. Zastosujemy integracyjne podejście Multi-Omics, aby zintegrować i skorelować dane, które uzyskaliśmy z obu typów danych (RNA-Seq).

9- pisanie i publikacja manuskryptu

Oczekujemy, że publikacja tego projektu zaowocuje co najmniej dwoma czasopismami o wysokim współczynniku wpływu z dziedziny genetyki molekularnej i kardiologii.

B.8. Kwalifikacje i kompetencje (max 2 strony):

Najważniejszą kwalifikacją jest dostępność profesjonalnych ekspertów kardiologii i genetyki molekularnej, którzy będą w stanie szybko przeprowadzić badanie. Ponadto w laboratoriach molekularnych krajowego centrum badawczego, fundacji Magdy Yaacoub i wielu innych prywatnych laboratoriach molekularnych w Egipcie dostępne są bardzo drogie, fundamentalnie krytyczne instrumenty, wymagane zarówno do profilowania ekspresji genów na mikromacierzach, jak i sekwencjonowania całego potoku jonów transkryptomu.

Najważniejszymi kompetencjami są wysokie koszty zestawów, chemikaliów, materiałów eksploatacyjnych i kilku drobnych przyrządów, które należy zakupić do pełnego przeprowadzenia projektu.