Genetik för ischemisk kardiomyopati

B.3. Resultat och effekt:

Det är en stor ära att sir Magdy yacoub reviderade detta projekt mer än en gång och det är en stor ära för mig och hela projektets team att han sir Magdy yaq. Accepterat att vara medutredare för detta projekt, Och detta återspeglar verkligen hans patriotism och hans oro för allt som ligger i egyptiernas hälsa. Att ta reda på genetiska biomarkörer och signaturer som kännetecknar ischemiska kardiomyopatipatienter och dilaterade kardiomyopatipatienter vid prekliniken stadium av hjärtsvikt, symtomatisk klinisk fas av hjärtsvikt och dekompenserad hjärtsvikt i slutstadiet. Dessa specifika biomarkörer kan i stor utsträckning användas som diagnostiska biomarkörer för IHD- och DCM-patienter med extremt hög risk för progression till senare allvarligt symtomatiska stadier av hjärtsvikt. Den tidiga screeningen av dessa patienter kan hjälpa till att förhindra deras progression till senare stadier av hjärtsvikt genom noggrann övervakning och terapeutiska och icke-terapeutiska strategier. Vi tar hänsyn till att de traditionella farmakologiska medlen som används för att bromsa eller förhindra utvecklingen av typiskt symtomatisk hjärtsviktspatienter - främst betablockerare och angiotensinkonverterande enzymhämmare - redan ordineras till alla IHD-patienter utan bevisad effekt för att förhindra utvecklingen av dessa. patienter till typiska hjärtsviktspatienter (patienter med vänsterkammardysfunktion). Baserat på ovanstående hypotes finns det ett stort behov av nya terapier som kan förhindra progressionen av strukturella hjärtsjukdomspatienter (stadium B hjärtsvikt) till typiska och slutstadiet hjärtsviktpatienter (stadium C och D hjärtsvikt).

De förväntade resultaten kan förklara nya genetiska vägar för den kliniska utvecklingen av asymtomatisk strukturell hjärtsjukdom (stadium B hjärtsvikt) till typiskt symtomatisk hjärtsvikt (stadium C) och dekompenserad hjärtsvikt (stadium D).

De förväntade resultaten av detta projekt kan leda oss till den nya grunden för den första egyptiska databasen över genetiska biomarkörer för olika hjärtsviktsstadier med underliggande IHD eller DCM.

Nyheten i idén och vår plan att använda de senaste teknikerna för genuttrycksprofilering och de mest uppdaterade bioinformatikmetoderna kan bana väg för publicering av resultaten av detta arbete i tidskriften med hög effektfaktor både inom molekylärgenetikområdet och kardiologiområdet.

Det förväntade resultatet av detta projekt kan vara en referens för många kandidater till master- och doktorsexamina inom området hjärtsvikt och hjärtmolekylär genetik i Egypten och runt om i världen. Nyheten i idén, med tanke på att det - för det mesta av vår kunskap - det inte finns några tidigare studier som undersökte den specifika genuttrycksprofileringen i olika stadier av hjärtsvikt, kan locka till sig höga poäng av citat av specialiserade forskare inom området.

Tidig screening av asymtomatiska strukturella hjärtsjukdomspatienter med hög risk för utveckling av progressiva hjärtsviktsstadier kan hjälpa till att förhindra deras progression genom farmakologiska och icke-farmakologiska strategier. Detta kan bidra till att spara en enorm mängd statliga pengar som spenderas på vård och behandling av dessa patienter i allvarligt symtomatiska dekompenserade stadier av hjärtsvikt.

Utredarnas plan är att ytterligare använda informationen som kommer att avslöjas i detta projekt för att tillämpa de senast undersökta teknikerna för RNA-aktivering och repression för att behandla med genöveruttryck och gendysreglering hos patienter som lider av progressiva stadier av hjärtsvikt VS. de i primära asymtomatiska stadier av hjärtsvikt för att bana väg för den innovativa nya genterapin för att förhindra progression från primära stadier till progressiva stadier av hjärtsvikt och återhämtning av patienter med hjärtsvikt i slutstadiet till stabila asymtomatiska normala livsstilsstadier av hjärtsvikt. sjukdom. Denna nya terapi kommer inte bara att bidra till att mildra eländet för ett så stort antal egyptier som lider av denna mycket invalidiserande sjukdom utan den kommer också att bli ett vetenskapligt revolutionerande genombrott inom genterapiområdet över hela världen. Vi är fulla av tro på att vi är egyptier som kan göra mirakel genom tålamod, beslutsamhet, kamp och tro på vår dröm.

B.4. State-of-the-art och excellens:

Hjärtsvikt (HF) drabbar uppskattningsvis 6,5 miljoner vuxna amerikaner [1]. Även om överlevnaden har ökat med 10 % mellan 1979 och 2000, är ​​den nuvarande 5-åriga dödligheten fortfarande cirka 50 % [1, 2]. Ett långvarigt paradigm är att hjärtsvikt i slutstadiet med reducerad ejektionsfraktion (HFrEF) utvecklas via en "slutlig gemensam väg" trots att de har en mängd olika etiologier och genetiska bidrag [3, 4]. Resultat från kliniska prövningar och nuvarande riktlinjer för hantering av HFrEF bekräftar denna synpunkt och direkt terapi baserad huvudsakligen på graden av vänsterkammars ejektionsfraktion och klinisk svårighetsgrad med användning av New York Heart Association (NYHA) klassificering [5].

Ischemisk hjärtsjukdom (IHD) är den vanligaste dödsorsaken globalt enligt WHO:s rapporter och är den vanligaste orsaken till hjärtsvikt i de utvecklade länderna [6-9]. Hjärtsvikt sekundärt till IHD har visat sig vara oberoende associerat med högre dödlighet jämfört med en icke-ischemisk etiologi [10, 11]. Den ökande incidensen har tillskrivits den höga effekten av den trombolytiska och primära perkutana kranskärlsinterventionen vid behandling av akuta hjärtinfarkter, vilket leder till förbättrad patientöverlevnad, men leder ofta till ökad sjuklighet på grund av ombyggnad av vänster kammare (LV) och kronisk vänster kammare. dysfunktion. Termen ischemisk kardiomyopati (ICM) har definierats som LV systolisk dysfunktion med en eller flera av följande: en historia av tidigare myokardiell revaskularisering eller hjärtinfarkt, mer än 75 % stenos i vänster huvudstam eller vänster främre nedåtgående artär, eller två kärl eller mer med mer än 75 % stenos [12].

En av de vanligaste orsakerna till hjärtsvikt är kardiomyopatier. American Heart Association beskrev kardiomyopatier som en heterogen grupp av hjärtsjukdomar som till övervägande del är genetiska och förknippade med mekanisk och/eller elektrisk dysfunktion [13]. DCM kännetecknas av närvaron av en vänsterkammar- eller biventrikulär dilatation och systolisk dysfunktion i frånvaro av onormala belastningsförhållanden. Det är den näst vanligaste orsaken till hjärtsvikt med minskad ejektionsfraktion. DCM är en komplex sjukdom med olika genetiska varianter och miljöfaktorer som bestämmer sjukdomsdebut och sjukdomsförlopp [14, 15].

IHD och kardiomyopatier inducerar modifiering av myokardiets struktur och kan leda till förändringar av hjärtfunktionen [16] inklusive en minskning av vänster ventrikulär ejektionsfraktion (LVEF). Identifiering av patienter i "pre-heart failure"-stadiet kan förhindra utvecklingen av HF genom implementering av anpassade medicinska och icke-medicinska strategier. Detta tysta prekliniska tillstånd (pre-hjärtsvikt) kallas asymtomatisk vänsterkammardysfunktion (ALVD) och kan endast urskiljas genom transthorax ekokardiografi. ALVD, vanlig i den allmänna befolkningen, leder till en hög risk att utveckla uppenbar HF. Faktum är att ALVD-personer har en 12-faldig ökning av den årliga sjukhusvistelsen för första händelse HF jämfört med individer med normal LVEF [17] och en 4-faldig ökning av risken för död under en 6-årsperiod [16] . Effektiv storskalig screening för ALVD, som representerar en stor ouppfylld klinisk utmaning, kräver en bestämning av ALVD-biomarkörer.

Screeningen för ALVD har börjat i över ett decennium [17], [18]. Det finns dock inga ALVD-biomarkörer. Faktum är att ALVD-diagnos kräver en komplicerad ekokardiografisk analys, som är tidskrävande, kostsam och inte tillämplig på den stora populationen av individer i riskzonen. Bristen på biomarkör(er) kan vara av stor betydelse eftersom ALVD är mycket utbredd på grund av den allmänna ökningen av kardiovaskulära riskfaktorer [19]. ALVD har fastställts som en prediktiv tidig indikator på svår HF [20]. Uppföljningsstudier har visat att patienter med ALVD uppvisar en genomsnittlig årlig kronisk hjärtsviktsfrekvens på 4,9 till 20 %, med en dödlighet på 5,1 till 10,5 % [21], [22]. Dessa observationer bekräftades nyligen i en 5-årig överlevnadsanalys som visade en dödlighet på 31 % för patienter med ALVD och 47 % för patienter som lider av systolisk HF [23]. Slutligen visade SOLVD-studien att behandlingen av ALVD avsevärt kan fördröja förekomsten av HF [24]. Därför kan det vara av yttersta klinisk betydelse att identifiera ALVD-individer i den allmänna befolkningen innan de utvecklar uppenbar HF.

Det finns ett fåtal prövningar som undersökte de genetiska biomarkörerna specifika för patienter med ischemisk hjärtsjukdom (IHD) (med eller utan tidigare historia av akut hjärtinfarkt) eller DCM-patienter som upprätthöll en normal vänsterkammarfunktion (stadium B), IHD- eller DCM-patienter med typisk symtomatisk hjärtsvikt (stadium C) och IHD- eller DCM-patienter som utvecklas till dekompenserad hjärtsvikt (stadium D). Maciejak et al, [25] undersökte de genetiska biomarkörerna för IHD-patienter med akut hjärtinfarkt (AMI) som utvecklade vänsterkammardysfunktion VS. patienter med akut hjärtinfarkt som bibehöll normal ventrikulär ejektionsfraktion samtidigt. De visade en förändrad genuttrycksprofil i AMI som utvecklade HF. Sweet et al, [26] analyserade hela transkriptomet hos patienter med ischemisk kardiomyopati (ICM) och DCM-patienter VS friska patienter utan historia av kardiovaskulära sjukdomar. De hittade nyckeletiologispecifika signaturer som kännetecknade ICM och DCM. Tijsen et al, [27] utförde mikro-RNA-array hos friska försökspersoner, patienter med hjärtsvikt, patienter med dyspné på grund av hjärtsvikt och patienter med dyspné av andra orsaker än hjärtsvikt. De identifierade 6 miRNA som är förhöjda hos patienter med HF, bland vilka miR423-5p var starkast relaterade till den kliniska diagnosen HF. Smih F et al, [28] undersökte, genom mikroarrayanalys, specifik genuttrycksprofil för asymtomatisk vänsterkammardysfunktion, nämligen patienter före hjärtsvikt. Ingen av de ovan nämnda försöken undersökte genuttrycksprofilerna eller genetiska biomarkörsignaturer specifika för progressiva symtomatiska stadier av hjärtsvikt VS. prekliniskt hjärtsviktstadium.

Tidigare mikroarraystudier avslöjade distinkta genuttryckssignaturer mellan HF-etiologier [28-33]; men andra lyckades inte hitta distinktioner [34, 35]. Direkt RNA-sekvensering (RNA-seq) ger också korrekt kvantifiering av transkript och har använts för att identifiera uttryckssignaturer mellan HF och icke-sviktande (NF) hjärtan [36], nya transkriptionsregulatorer och störda miRNA-nätverk i ICM eller DCM [37 , 38], pre- och post-LVAD-transkriptom [39, 40], vanliga HF-gener i pediatrisk kardiomyopati [41], och splitsning, eQTL och alleliskt uttryck i DCM [42].

Vi antar att den fulla förståelsen av de specifika genetiska variationerna såsom genöveruttryck eller gendysreglering i sådana kohorter av patienter med IHD eller DCM som går vidare till senare stadier av hjärtsvikt VS. IHD- eller DCM-patienter som bibehåller normal systolisk funktion kan bana väg för att ta reda på diagnostiska genetiska biomarkörer för IHD-patienter och DCM-patienter med hög risk för progression till senare stadier av hjärtsvikt. Att ta reda på differentiella genuttrycksprofiler hos IHD- och DCM-patienter i olika stadier av hjärtsvikt kan dessutom vara det första steget för innovationen av nya genterapier för att förebygga hjärtsviktsprogression hos IHD-patienter i stadium B och återhämtning av IHD-patienter vid progressiva stadier av hjärtsvikt (C och D).

B.7. Tillvägagångssätt och metodik:

1. Projektledning och konsortium

2. Patientrekrytering och tilldelning Protokollet för denna studie kommer att utformas och granskas i stor omfattning av den institutionella granskningsnämnden vid Asyut Universitys kardiologiska sjukhus. Alla patienter kommer att uppmanas att underteckna ett detaljerat informerat samtycke före rekrytering.

   Inklusionskriterier: IHD- eller DCM-patienter utan HF-symtom (stadium B), med typiska HF-symtom (stadium C) och patienter med dekompenserad HF (stadium D).

   Uteslutningskriterier: Patienter med andra strukturella hjärtsjukdomar än IHD eller DCM.

   IHD-patienter eller DCM-patienter som följs upp på Assyut University kardiologiska sjukhus kommer att rekryteras i denna studie.

   Alla rekryterade patienter kommer att genomgå fullständiga laboratorieundersökningar och fullständig fysisk undersökning av minst två kardiologer på sjukhuset. Alla patienter kommer att genomgå ekokardiografisk undersökning för strukturell hjärtsjukdom upptäckt och bekräftelse och noggrann mätning av ejektionsfraktion för hjärtsviktsstadieindelning.

   Rekryterade patienter kommer att tilldelas en av studiegrupperna enligt det aktuella kliniska skedet av hjärtsvikt.

   Grupp A: IHD-patienter utan kliniska symtom på hjärtsvikt och normal vänsterkammarsystolisk funktion (prekliniskt stadium eller stadium B hjärtsvikt) Grupp B: IHD-patienter med typiska kliniska symtom på hjärtsvikt tillsammans med reducerad ejektionsfraktion < 35 % ( stadium C hjärtsvikt) Grupp C: IHD-patienter med dekompenserad hjärtsvikt (stadium D hjärtsvikt) Grupp D: DCM-patienter utan kliniska symtom på hjärtsvikt och normal vänsterkammarsystolisk funktion (prekliniskt stadium eller stadium B hjärtsvikt) Grupp E: DCM-patienter med typiska kliniska symtom på hjärtsvikt tillsammans med reducerad ejektionsfraktion < 35 % (stadium C hjärtsvikt) Grupp F: DCM-patienter med dekompenserad hjärtsvikt (stadium D hjärtsvikt)

   Patienter kommer att rekryteras från de externa kardiologiska klinikerna, den interna kardiologiska avdelningen och intensivhjärtvårdsavdelningen vid Assyut University som undervisar i kardiologiskt sjukhus.

   Beräkning av urvalsstorlek Vi beräknar urvalsstorleken för IHD-patienter enligt ekvationen för urvalsstorleken för beskrivande studiedesign (43) baserat på prevalensen av total CHD-prevalens är 6,7 % hos vuxna i USA ≥ 20 år och prevalensen av DCM är 5-8 per 100 000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Provstorlek Z1-α/2= Representerar antalet standardfel från medelvärdet (konstant = 1,96) P= Representerar andelen av den bästa gissningen om värdet av andelen av intresse. = prevalens D= den absoluta precision som krävs på vardera sidan av proportionen eller avståndet; hur nära andelen intresse uppskattningen önskas ligga. 0,05.

   Den urvalsstorlek som krävs för IHD-patienter baserat på prevalensen på 0,067 kommer att vara 96 ​​patienter.

   Den provstorlek som krävs för DCM-patienter baserat på prevalensen på 0,008 kommer att vara 11 patienter. Den totala provstorleken (inklusive kontrollpersoner) är 107 patienter.

3. Hjärtbiopsi

   Bioptom kommer att användas för ventrikulär vävnadsextraktion (biopsi). De extraherade proverna kommer att förvaras i flytande kväve i -80 grader Celsius.

4. Import av kit, kemikalier och förbrukningsvaror
5. RNA-extraktion Totalt RNA kommer att extraheras från vävnadsprover från patienter med olika kliniska hjärtsviktsstadier och friska personer som använder Tempus TM spin RNA Isolation Kit i Tempus TM Blood RNA Tube som rekommenderas av tillverkarens instruktioner (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (Bilaga A)

7- RNA-sekvensering

(Thermofisher Ion Torrent-plattform): alternativ A

Verkligen fullständig transkriptomisolering för nästa generations sekvensanalys kommer att produceras med hjälp av RiboMinus™ Eukaryote System v2 (bilaga C). Ion Total RNA-Seq Kit v2 kommer att användas för enkel RNA-bibliotekskonstruktion (Bilaga D). Ion Chef-systemet kommer att användas för att förbereda mallar som går bort och ladda spånen (bilaga E). Ion GeneStudio S5-systemen kommer att användas för sekvensering av genpaneler hela vägen till transkriptomen (bilaga F). Torrent Suite Software tillhandahåller automatiskt sekvensläsningarna i exporterbara FASTQ- eller BAM-format (bilaga G).

8- Bioinformatik och dataanalys

Torrent Suite Software "RNASeqAnalysis" Plugin kommer att användas för initial analys inklusive RNA-transkriptanpassning och kvantifiering. Vi kommer att använda hg19 som ett mänskligt referensgenom, där fullständiga och partiella anpassningar kommer att detekteras med både STAR- och Bowtie2-kartare. Picard-verktyg kommer att användas för att räkna läsningar anpassade till varje gen, medan manschettknappar kommer att användas för att representera olika isoformer för varje gen. Omfattande plotter kommer att genereras för enskilda prover, såväl som plots som jämför prover. Den ytterligare specifika analysen kommer att uppnås med hjälp av egenutvecklade skript (i python eller R) för beräkning av veckförändringar, identifiering av upp- och nedreglerade gener/isoformer och analys av väganrikning med Cytoscape-mjukvara. Bananrikningsanalys kan identifiera vägar som kan ha en roll i sjukdomen på en tidsseriedata. Vi kommer att tillämpa en integrativ Multi-Omics-metod för att integrera och korrelera data vi erhållit från båda typerna av data (RNA-Seq).

9- manuskriptskrivning och publicering

Vi förväntar oss att publiceringen av detta projekt resulterar i minst två tidskrifter med hög effektfaktor inom området molekylärgenetik och kardiologi.

B.8. Kvalifikationer och kompetenser (max 2 sidor):

Den viktigaste kvalifikationen är tillgången till professionella kardiologi- och molekylärgenetiska experter som snabbt kommer att kunna genomföra studien. Mycket dyra fundamentalt kritiska instrument som krävs för både mikroarray-genexpressionsprofilering och hel transkriptomjon torrent-RNA-sekvensering är tillgängliga i molekylära laboratorier i det nationella forskningscentret, Magdy Yaacoub Foundation och många andra privata molekylära laboratorier i Egypten.

De viktigaste kompetenserna är de höga kostnaderna för kit, kemikalier, förbrukningsvaror och några mindre instrument som bör köpas för att hela projektet ska kunna genomföras.