Genetikk av iskemisk kardiomyopati

B.3. Utfall og effekt:

Det er en stor ære at sir Magdy yacoub reviderte dette prosjektet mer enn én gang, og det er en stor ære for meg og hele prosjektets team at han sir Magdy yaq. Akseptert som medetterforsker av dette prosjektet, og dette gjenspeiler virkelig hans patriotisme og hans bekymring for alt som er i helsen til egypterne. Finne ut genetiske biomarkører og signaturer som kjennetegner iskemiske kardiomyopatipasienter og dilatert kardiomyopatipasienter ved preklinisk stadium av hjertesvikt, symptomatisk klinisk stadium av hjertesvikt og dekompensert sluttstadium hjertesvikt. Disse spesifikke biomarkørene kan i stor grad brukes som diagnostiske biomarkører for IHD- og DCM-pasienter med ekstremt høy risiko for progresjon til senere alvorlig symptomatiske stadier av hjertesvikt. Tidlig screening av disse pasientene kan bidra til å forhindre deres progresjon til senere stadier av hjertesvikt ved nøye overvåking og terapeutiske og ikke-terapeutiske strategier. Vi tar i betraktning at de tradisjonelle farmakologiske midlene som brukes til å bremse eller forhindre progresjon av typisk symptomatisk hjertesviktpasienter - hovedsakelig betablokkere og angiotensinkonverterende enzymhemmere - allerede er foreskrevet til alle IHD-pasienter uten bevist effekt for å forhindre progresjon av disse. pasienter til typiske hjertesviktpasienter (pasienter med venstre ventrikkel dysfunksjon). Basert på hypotesen ovenfor er det et stort behov for nye terapier som kan forhindre progresjon av strukturelle hjertesykdomspasienter (stadium B hjertesvikt) til typiske og sluttstadium hjertesviktpasienter (stadium C og D hjertesvikt).

De forventede resultatene kan forklare nye genetiske veier for den kliniske progresjonen av asymptomatisk strukturell hjertelidelse (stadium B hjertesvikt) til typisk symptomatisk hjertesvikt (stadium C) og dekompensert hjertesvikt (stadium D).

De forventede resultatene av dette prosjektet kan føre oss til det nye grunnlaget for den første egyptiske databasen over genetiske biomarkører for forskjellige hjertesviktstadier med underliggende IHD eller DCM.

Nyheten til ideen og planen vår om å bruke de nyeste teknikkene for genuttrykksprofilering og de mest oppdaterte bioinformatikkmetodikkene kan bane vei for å publisere resultatene av dette arbeidet i tidsskriftet med høy effektfaktor både innen molekylærgenetikk og kardiologi.

Det forventede resultatet av dette prosjektet kan være en referanse for mange kandidater til mastergrader og doktorgrader innen hjertesvikt og hjertemolekylær genetikk i Egypt og rundt om i verden. Nyheten til ideen, gitt at det – for det meste av vår kunnskap – ikke er noen tidligere studier som undersøkte den spesifikke genekspresjonsprofileringen i forskjellige stadier av hjertesvikt, kan tiltrekke seg høye referanser fra spesialiserte forskere på området.

Tidlig screening av asymptomatiske strukturelle hjertesykdomspasienter med høy risiko for utvikling av progressive hjertesviktstadier kan bidra til å forhindre deres progresjon med farmakologiske og ikke-farmakologiske strategier. Dette kan bidra til å spare en enorm mengde statlige penger brukt på pleie og behandling av pasienter i alvorlig symptomatisk dekompenserte stadier av hjertesvikt.

Planen til etterforskerne er å videre bruke informasjonen som vil bli avslørt i dette prosjektet til å anvende de sist undersøkte teknikkene for RNA-aktivering og -undertrykkelse for å behandle med genoverekspresjon og gendysregulering hos pasienter som lider av progressive stadier av hjertesvikt VS. de i primære asymptomatiske stadier av hjertesvikt for å bane vei for den innovative nye genterapien for forebygging av progresjon fra primærstadier til progressive stadier av hjertesvikt og gjenoppretting av sluttstadium hjertesviktpasienter til stabile asymptomatiske normale livsstilsstadier i sykdom. Denne nye terapien vil ikke bare bidra til å dempe elendigheten til et så stort antall egyptere som lider av denne svært invalidiserende sykdommen, men den vil også være et vitenskapelig revolusjonerende gjennombrudd innen genterapi over hele verden. Vi er fulle av tro på at vi er egypterne som kan gjøre mirakler ved tålmodighet, besluttsomhet, kamp og tro på drømmen vår.

B.4. State-of-the-art og fortreffelighet:

Hjertesvikt (HF) påvirker anslagsvis 6,5 millioner voksne amerikanere [1]. Selv om overlevelsesraten har økt med 10 % mellom 1979 og 2000, er den nåværende 5-års dødeligheten fortsatt rundt 50 % [1, 2]. Et langvarig paradigme er at hjertesvikt i sluttstadiet med redusert ejeksjonsfraksjon (HFrEF) utvikler seg via en "endelig felles vei" til tross for at de har et bredt utvalg av etiologier og genetiske bidrag [3, 4]. Resultater fra kliniske forsøk og gjeldende retningslinjer for håndtering av HFrEF bekrefter dette synspunktet og direkte terapi basert hovedsakelig på graden av venstre ventrikkel ejeksjonsfraksjon, og klinisk alvorlighetsgrad ved bruk av New York Heart Association (NYHA) klassifisering [5].

Iskemisk hjertesykdom (IHD) er den vanligste dødsårsaken globalt ifølge WHO-rapporter og er den ledende årsaken til hjertesvikt i utviklede land [6-9]. Hjertesvikt sekundært til IHD har blitt funnet å være uavhengig assosiert med høyere dødelighet sammenlignet med en ikke-iskemisk etiologi [10, 11]. Den økende forekomsten har blitt tilskrevet den høye effekten av den trombolytiske og primære perkutane koronar intervensjonen i behandlingen av akutte hjerteinfarkter, noe som fører til forbedret pasientoverlevelse, men som ofte fører til økt sykelighet på grunn av venstre ventrikkel (LV) remodellering og kronisk venstre ventrikkel. dysfunksjon. Begrepet iskemisk kardiomyopati (ICM) har blitt definert som LV systolisk dysfunksjon med ett eller flere av følgende: en historie med tidligere myokardrevaskularisering eller hjerteinfarkt, mer enn 75 % stenose i venstre hovedstamme eller venstre nedadgående arterie, eller to kar eller mer med mer enn 75 % stenose [12].

En av de vanligste årsakene til hjertesvikt er kardiomyopatier. American Heart Association beskrev kardiomyopatier som en heterogen gruppe av hjertesykdommer som hovedsakelig er genetiske og assosiert med mekanisk og/eller elektrisk dysfunksjon [13]. DCM er preget av tilstedeværelsen av venstre ventrikkel eller biventrikulær dilatasjon og systolisk dysfunksjon i fravær av unormale belastningsforhold. Det er den nest vanligste årsaken til hjertesvikt med redusert ejeksjonsfraksjon. DCM er en kompleks lidelse med ulike genetiske varianter og miljøfaktorer som bestemmer sykdomsutbruddet og sykdomsforløpet [14, 15].

IHD og kardiomyopatier induserer modifikasjon av myokardstrukturen og kan føre til endringer i hjertefunksjonen [16] inkludert en reduksjon i venstre ventrikkel ejeksjonsfraksjon (LVEF). Identifisering av pasienter på «pre-hjertesvikt»-stadiet kan forhindre utvikling av HF gjennom implementering av tilpassede medisinske og ikke-medisinske strategier. Denne stille prekliniske tilstanden (pre-hjertesvikt) refereres til som asymptomatisk venstre ventrikkel dysfunksjon (ALVD) og kan bare skjelnes ved transthorax ekkokardiografi. ALVD, vanlig i befolkningen generelt, fører til høy risiko for å utvikle åpen HF. ALVD-personer har faktisk en 12-dobling i den årlige sykehusinnleggelsesraten for førstehendelses-HF sammenlignet med individer med normal LVEF [17] og en 4-dobling i risikoen for død over en 6-årsperiode [16] . Effektiv storskala screening for ALVD, som representerer en stor uoppfylt klinisk utfordring, krever en bestemmelse av ALVD-biomarkører.

Screeningen for ALVD har startet i over et tiår [17], [18]. Imidlertid er det ingen ALVD-biomarkører. ALVD-diagnose garanterer faktisk en komplisert ekkokardiografisk analyse, som er tidkrevende, kostbar og ikke aktuelt for den store populasjonen av individer i fare. Mangelen på biomarkør(er) kan være av stor betydning fordi ALVD er svært utbredt på grunn av den generelle økningen i kardiovaskulære risikofaktorer [19]. ALVD har blitt etablert som en prediktiv tidlig indikator på alvorlig HF [20]. Oppfølgingsstudier har vist at pasienter med ALVD viser en gjennomsnittlig årlig kronisk hjertesviktrate på 4,9 til 20 %, med en dødelighet på 5,1 til 10,5 % [21], [22]. Disse observasjonene ble nylig bekreftet i en 5-års overlevelsesrate som viste en dødsrate på 31 % for pasienter med ALVD og på 47 % for pasienter med systolisk HF [23]. Til slutt viste SOLVD-studien at behandling av ALVD kan forsinke forekomsten av HF betydelig [24]. Derfor kan det være av største klinisk betydning å identifisere ALVD-individer i den generelle befolkningen før de utvikler åpenlyst HF.

Det er et lite antall studier som undersøkte de genetiske biomarkørene spesifikke for pasienter med iskemisk hjertesykdom (IHD) (med eller uten tidligere historie med akutt hjerteinfarkt) eller DCM-pasienter som opprettholdt en normal venstre ventrikkelfunksjon (stadium B), IHD- eller DCM-pasienter med typisk symptomatisk hjertesvikt (stadium C) og IHD- eller DCM-pasienter som utvikler seg til dekompensert hjertesvikt (stadium D). Maciejak et al, [25] undersøkte de genetiske biomarkørene til IHD-pasienter med akutt hjerteinfarkt (AMI) som utviklet venstre ventrikkeldysfunksjon VS. pasienter med akutt hjerteinfarkt som beholdt normal ventrikulær ejeksjonsfraksjon samtidig varighet. De demonstrerte en endret genekspresjonsprofil i AMI som utviklet HF. Sweet et al, [26] analyserte hele transkriptomet hos pasienter med iskemisk kardiomyopati (ICM) og DCM-pasienter VS friske pasienter uten historie med kardiovaskulære sykdommer. De fant nøkkeletiologispesifikke signaturer som karakteriserte ICM og DCM. Tijsen et al, [27] utførte mikro-RNA-array hos friske personer, hjertesviktpasienter, pasienter med dyspné på grunn av hjertesvikt og pasienter med dyspné av andre årsaker enn hjertesvikt. De identifiserte 6 miRNA som er forhøyet hos pasienter med HF, blant dem var miR423-5p sterkest relatert til den kliniske diagnosen HF. Smih F et al, [28] undersøkte, ved mikroarray-analyse, spesifikk genekspresjonsprofil for asymptomatisk venstre ventrikkeldysfunksjon, nemlig pasienter før hjertesvikt. Ingen av de ovennevnte forsøkene undersøkte genuttrykksprofilene eller genetiske biomarkørsignaturer spesifikke for progressive symptomatiske stadier av hjertesvikt VS. preklinisk hjertesviktstadium.

Tidligere mikroarray-studier avslørte distinkte genekspresjonssignaturer mellom HF-etiologier [28-33]; men andre klarte ikke å finne distinksjoner [34, 35]. Direkte RNA-sekvensering (RNA-seq) gir også nøyaktig kvantifisering av transkripsjoner og har blitt brukt til å identifisere ekspresjonssignaturer mellom HF og ikke-sviktende (NF) hjerter [36], nye transkripsjonsregulatorer og forstyrrede miRNA-nettverk i ICM eller DCM [37 , 38], pre- og post-LVAD-transkriptomer [39, 40], vanlige HF-gener i pediatrisk kardiomyopati [41], og spleising, eQTL og allelekspresjon i DCM [42].

Vi antar at den fulle forståelsen av de spesifikke genetiske variasjonene som genoveruttrykk eller gendysregulering i slike kohorter av pasienter med IHD eller DCM som går videre til senere stadier av hjertesvikt VS. IHD- eller DCM-pasienter som beholder normal systolisk funksjon kan bane vei for å finne ut diagnostiske genetiske biomarkører for IHD-pasienter og DCM-pasienter med høy risiko for progresjon til senere stadier av hjertesvikt. Dessuten kan det å finne ut differensielle genekspresjonsprofiler hos IHD- og DCM-personer ved forskjellige stadier av hjertesvikt være det første trinnet for innovasjon av nye genterapier for forebygging av hjertesviktprogresjon hos IHD-pasienter på stadium B og restitusjon av IHD-pasienter ved progressive stadier av hjertesvikt (C og D).

B.7. Tilnærming og metodikk:

1. Prosjektledelse og konsortium

2. Pasientrekruttering og tildeling Protokollen for denne studien vil bli omfattende utformet og gjennomgått av den institusjonelle vurderingsnemnda ved Asyut University pedagogisk kardiologisk sykehus. Alle pasienter vil bli bedt om å signere et detaljert informert samtykke før rekruttering.

   Inklusjonskriterier: IHD- eller DCM-pasienter uten HF-symptomer (stadium B), med typiske HF-symptomer (stadium C) og pasienter med dekompensert HF (stadium D).

   Eksklusjonskriterier: Pasienter med andre strukturelle hjertesykdommer enn IHD eller DCM.

   IHD-pasienter eller DCM-pasienter som følges opp på Assyut University pedagogisk kardiologisk sykehus vil bli rekruttert i denne studien.

   Alle rekrutterte pasienter vil gjennomgå fullstendige laboratorieundersøkelser og fullstendig fysisk undersøkelse av minst to kardiologer ved sykehuset. Alle pasienter vil gjennomgå ekkokardiografisk undersøkelse for strukturell hjertesykdomsdeteksjon og bekreftelse og nøyaktig måling av ejeksjonsfraksjon for hjertesviktstadie.

   Rekrutterte pasienter vil bli allokert til en av studiegruppene i henhold til gjeldende klinisk stadium av hjertesvikt.

   Gruppe A: IHD-pasienter uten kliniske symptomer på hjertesvikt og normal venstre ventrikkel systolisk funksjon (pre-klinisk stadium eller stadium B hjertesvikt) Gruppe B: IHD-pasienter med typiske kliniske symptomer på hjertesvikt sammen med redusert ejeksjonsfraksjon < 35 % ( stadium C hjertesvikt) Gruppe C: IHD-pasienter med dekompensert hjertesvikt (stadium D hjertesvikt) Gruppe D: DCM-pasienter uten kliniske symptomer på hjertesvikt og normal venstre ventrikkel systolisk funksjon (pre-klinisk stadium eller stadium B hjertesvikt) Gruppe E: DCM-pasienter med typiske kliniske symptomer på hjertesvikt sammen med redusert ejeksjonsfraksjon < 35 % (stadium C hjertesvikt) Gruppe F: DCM-pasienter med dekompensert hjertesvikt (stadium D hjertesvikt)

   Pasienter vil bli rekruttert fra eksterne kardiologiske klinikker, intern kardiologisk avdeling og intensiv hjerteavdeling ved Assyut University som underviser kardiologisk sykehus.

   Beregning av utvalgsstørrelse Vi beregner utvalgsstørrelsen til IHD-pasienter i henhold til ligningen for utvalgsstørrelsen for beskrivende studiedesign (43) basert på prevalensen av total CHD-prevalens er 6,7 % hos voksne i USA ≥ 20 år og prevalensen av DCM er 5-8 per 100 000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Prøvestørrelse Z1-α/2= Representerer antall standardfeil fra gjennomsnittet (konstant = 1,96) P= Representer andelen av den beste gjetningen om verdien av andelen av interesse. = prevalens D= den absolutte presisjonen som kreves på hver side av proporsjonen, eller avstanden; hvor nær andelen av interesse estimatet ønskes å være. 0,05.

   Prøvestørrelsen som kreves for IHD-pasienter basert på prevalensraten på 0,067 vil være 96 pasienter.

   Prøvestørrelsen som kreves for DCM-pasienter basert på prevalensraten på 0,008 vil være 11 pasienter. Den totale prøvestørrelsen (inkludert kontrollpersoner) er 107 pasienter.

3. Hjertebiopsi

   Bioptom vil bli brukt til ekstraksjon av ventrikkelvev (biopsi). De ekstraherte prøvene vil bli reservert i flytende nitrogen ved -80 grader Celsius.

4. Import av sett, kjemikalier og forbruksvarer
5. RNA-ekstraksjon Totalt RNA vil bli ekstrahert fra vevsprøver fra pasienter med forskjellige kliniske hjertesviktstadier og friske personer som bruker Tempus TM spin RNA isolasjonssett i Tempus TM Blood RNA Tube anbefalt av produsentens instruksjoner (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (vedlegg A)

7- RNA-sekvensering

(Thermofisher Ion Torrent-plattform): alternativ A

Virkelig fullstendig transkriptomisolering for neste generasjons sekvenseringsanalyse vil bli produsert ved bruk av RiboMinus™ Eukaryote System v2 (vedlegg C). Ion Total RNA-Seq Kit v2 vil bli brukt til enkel RNA-bibliotekkonstruksjon (vedlegg D). Ion Chef-systemet vil bli brukt for klargjøring av maler og sponlasting (vedlegg E). Ion GeneStudio S5-systemene vil bli brukt for sekvensering av genpaneler helt til transkriptomet (vedlegg F). Torrent Suite-programvaren gir automatisk sekvenslesingene i eksporterbare FASTQ- eller BAM-formater (vedlegg G).

8- Bioinformatikk og dataanalyse

Torrent Suite-programvaren "RNASeqAnalysis"-plugin vil bli brukt for innledende analyse, inkludert RNA-transkripsjonsjustering og kvantifisering. Vi vil bruke hg19 som et humant referansegenom, hvor full og delvis justering vil bli oppdaget ved bruk av både STAR og Bowtie2 kartleggere. Picard-verktøy vil bli brukt for å telle avlesninger justert til hvert gen, mens mansjettknapper-programvare vil bli brukt til å representere forskjellige isoformer for hvert gen. Det vil bli generert omfattende plott for individuelle prøver, samt plott som sammenligner prøver. Den videre spesifikke analysen vil bli oppnådd ved å bruke egenutviklede skript (i python eller R) for beregning av fold endring, identifisering av opp- og nedregulerte gener/isoformer og analyse av anrikningsveier ved bruk av Cytoscape-programvare. Baneanrikningsanalyse kan identifisere veier som kan ha en rolle i sykdommen på en tidsseriedata. Vi vil bruke en integrerende Multi-Omics-tilnærming for å integrere og korrelere data vi har hentet fra begge typer data (RNA-Seq).

9- manuskriptskriving og publisering

Vi forventer at publiseringen av dette prosjektet resulterer i minst to tidsskrifter med høy effektfaktor innen molekylærgenetikk og kardiologi.

B.8. Kvalifikasjoner og kompetanse (maks 2 sider):

Den viktigste kvalifikasjonen er tilgjengeligheten av profesjonelle kardiologi- og molekylærgenetiske eksperter som raskt vil kunne gjennomføre studien. Svært dyre fundamentalt kritiske instrumenter som kreves for både mikroarray-genekspresjonsprofilering og hel transkriptomion torrent RNA-sekvensering er tilgjengelig i de molekylære laboratoriene til det nasjonale forskningssenteret, Magdy Yaacoub-stiftelsen og mange andre private molekylære laboratorier i Egypt.

De viktigste kompetansene er de høye kostnadene for settene, kjemikalier, forbruksvarer og noen mindre instrumenter som bør kjøpes for fullstendig gjennomføring av prosjektet.