Genetica della cardiomiopatia ischemica

B.3. Risultati e impatto:

È un grande onore che sir Magdy yacoub abbia rivisto questo progetto più di una volta ed è un grande onore per me e per tutto il team del progetto che sir Magdy yaq. Ha accettato di essere il co-investigatore di questo progetto, e questo riflette veramente il suo patriottismo e la sua preoccupazione per tutto ciò che è nell'interesse della salute degli egiziani. Scoprire biomarcatori genetici e firme che caratterizzano i pazienti con cardiomiopatia ischemica e con cardiomiopatia dilatativa in fase preclinica. stadio dell'insufficienza cardiaca, stadio clinico sintomatico dell'insufficienza cardiaca e insufficienza cardiaca scompensata allo stadio terminale. Questi biomarcatori specifici possono essere ampiamente utilizzati come biomarcatori diagnostici per i pazienti con IHD e DCM a rischio estremamente elevato di progressione verso successivi stadi gravemente sintomatici di insufficienza cardiaca. Lo screening precoce di questi pazienti può aiutare a prevenire la loro progressione verso stadi successivi di insufficienza cardiaca mediante un attento monitoraggio e strategie terapeutiche e non terapeutiche. Prendiamo in considerazione che i tradizionali agenti farmacologici utilizzati per rallentare o prevenire la progressione dei pazienti con insufficienza cardiaca tipicamente sintomatica - principalmente beta-bloccanti e inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina - sono già prescritti a tutti i pazienti con IHD senza provata efficacia per prevenire la progressione di quelli pazienti con insufficienza cardiaca tipica (pazienti con disfunzione ventricolare sinistra). Sulla base dell'ipotesi di cui sopra, vi è un grande bisogno di nuove terapie che possano prevenire la progressione dei pazienti con cardiopatia strutturale (insufficienza cardiaca di stadio B) a pazienti con insufficienza cardiaca tipica e terminale (insufficienza cardiaca di stadio C e D).

I risultati attesi potrebbero spiegare nuovi percorsi genetici della progressione clinica del disturbo cardiaco strutturale asintomatico (insufficienza cardiaca in stadio B) a insufficienza cardiaca tipicamente sintomatica (stadio C) e insufficienza cardiaca scompensata (stadio D).

I risultati attesi di questo progetto potrebbero portarci alla nuova fondazione del primo database egiziano dei biomarcatori genetici di diversi stadi di insufficienza cardiaca con sottostante IHD o DCM.

La novità dell'idea e il nostro progetto di utilizzare le più recenti tecniche di profilazione dell'espressione genica e le più aggiornate metodologie bioinformatiche possono aprire la strada alla pubblicazione dei risultati di questo lavoro su riviste ad alto fattore di impatto sia nel campo della genetica molecolare che in quello della cardiologia.

Il risultato atteso di questo progetto può essere un riferimento per molti candidati di master e dottorati nel campo dello scompenso cardiaco e della genetica molecolare cardiaca in Egitto e nel mondo. La novità dell'idea, dato che - per la maggior parte delle nostre conoscenze - non ci sono studi precedenti che abbiano indagato il profilo di espressione genica specifica nelle diverse fasi dell'insufficienza cardiaca, può attrarre un alto punteggio di citazione da parte di scienziati specializzati nel campo.

Lo screening precoce dei pazienti con cardiopatia strutturale asintomatica ad alto rischio di sviluppo di stadi di insufficienza cardiaca progressiva può aiutare a prevenire la loro progressione mediante strategie farmacologiche e non farmacologiche. Ciò può contribuire a risparmiare un'enorme quantità di denaro del governo speso per la cura e il trattamento di quei pazienti in stadi gravemente sintomatici scompensati di scompenso cardiaco.

Il piano dei ricercatori è di utilizzare ulteriormente le informazioni che verranno rivelate in questo progetto per applicare le tecniche più recentemente studiate di attivazione e repressione dell'RNA per trattare con sovraespressione genica e disregolazione genica in pazienti affetti da stadi progressivi di insufficienza cardiaca VS. quelli nelle fasi asintomatiche primarie dell'insufficienza cardiaca per aprire la strada alla nuova terapia genica innovativa per la prevenzione della progressione dalle fasi primarie alle fasi progressive dell'insufficienza cardiaca e il recupero dei pazienti con insufficienza cardiaca allo stadio terminale alle normali fasi di vita asintomatiche stabili dell'insufficienza cardiaca patologia. Questa nuova terapia non solo contribuirà a mitigare la miseria di un numero così elevato di egiziani che soffrono di questa malattia altamente invalidante, ma rappresenterà anche una svolta scientifica rivoluzionaria nel campo della terapia genica in tutto il mondo. Siamo pieni di fede che noi egiziani possiamo fare miracoli con pazienza, determinazione, lotta e fede nel nostro sogno.

B.4. Stato dell'arte ed eccellenza:

L'insufficienza cardiaca (HF) colpisce circa 6,5 ​​milioni di americani adulti [1]. Sebbene i tassi di sopravvivenza siano aumentati del 10% tra il 1979 e il 2000, l'attuale tasso di mortalità a 5 anni è ancora di circa il 50% [1, 2]. Un paradigma di lunga data è che l'insufficienza cardiaca allo stadio terminale con frazione di eiezione ridotta (HFrEF) si evolve attraverso un "percorso comune finale" nonostante abbia un'ampia varietà di eziologie e contributi genetici [3, 4]. I risultati degli studi clinici e le attuali linee guida per la gestione dell'HFrEF confermano questo punto di vista e la terapia diretta basata principalmente sul grado di frazione di eiezione ventricolare sinistra e sulla gravità clinica utilizzando la classificazione della New York Heart Association (NYHA) [5].

La cardiopatia ischemica (IHD) è la causa di morte più comune a livello globale secondo i rapporti dell'OMS ed è la principale causa di insufficienza cardiaca nei paesi sviluppati [6-9]. È stato riscontrato che l'insufficienza cardiaca secondaria a IHD è indipendentemente associata a tassi di mortalità più elevati rispetto a un'eziologia non ischemica [10, 11]. L'aumento dell'incidenza è stato attribuito all'elevata efficacia dell'intervento coronarico percutaneo trombolitico e primario nel trattamento degli infarti miocardici acuti, portando a una migliore sopravvivenza del paziente, tuttavia spesso portando a un aumento della morbilità dovuto al rimodellamento del ventricolo sinistro (LV) e al ventricolo sinistro cronico disfunzione. Il termine cardiomiopatia ischemica (ICM) è stato definito come una disfunzione sistolica del ventricolo sinistro con una o più delle seguenti condizioni: anamnesi di precedente rivascolarizzazione miocardica o infarto miocardico, stenosi superiore al 75% nel tronco principale sinistro o nell'arteria discendente anteriore sinistra, o due vasi o più con una stenosi superiore al 75% [12].

Una delle cause più comuni di insufficienza cardiaca sono le cardiomiopatie. L'American Heart Association ha descritto le cardiomiopatie come un gruppo eterogeneo di malattie del miocardio che sono prevalentemente genetiche e associate a disfunzioni meccaniche e/o elettriche [13]. La DCM è caratterizzata dalla presenza di una dilatazione ventricolare sinistra o biventricolare e disfunzione sistolica in assenza di condizioni di carico anomale. È la seconda causa più comune di insufficienza cardiaca con ridotta frazione di eiezione. La DCM è una malattia complessa con diverse varianti genetiche e fattori ambientali che determinano l'insorgenza e il decorso della malattia [14, 15].

IHD e cardiomiopatie inducono modifiche della struttura del miocardio e possono portare ad alterazioni della funzione cardiaca [16] inclusa una riduzione della frazione di eiezione ventricolare sinistra (LVEF). L'identificazione dei pazienti nella fase "pre-insufficienza cardiaca" può prevenire lo sviluppo di scompenso cardiaco attraverso l'implementazione di strategie mediche e non mediche adattate. Questo stato preclinico silenzioso (pre-insufficienza cardiaca) è indicato come disfunzione ventricolare sinistra asintomatica (ALVD) e può essere discriminato solo dall'ecocardiografia transtoracica. L'ALVD, comune nella popolazione generale, comporta un rischio elevato di sviluppare scompenso cardiaco conclamato. Infatti, i soggetti ALVD hanno un aumento di 12 volte del tasso annuo di ospedalizzazione per scompenso cardiaco al primo evento rispetto agli individui con LVEF normale [17] e un aumento di 4 volte del rischio di morte in un periodo di 6 anni [16] . Uno screening efficace su larga scala per l'ALVD, che rappresenta una grande sfida clinica non soddisfatta, richiede una determinazione dei biomarcatori dell'ALVD.

Lo screening per ALVD è iniziato da oltre un decennio [17], [18]. Tuttavia, non ci sono biomarcatori ALVD. In effetti, la diagnosi di ALVD richiede un'analisi ecocardiografica complicata, che richiede tempo, è costosa e non è applicabile alla vasta popolazione di individui a rischio. La mancanza di biomarcatori può essere di grande importanza perché l'ALVD è altamente prevalente a causa dell'aumento generale dei fattori di rischio cardiovascolare [19]. L'ALVD è stato stabilito come un indicatore predittivo precoce di insufficienza cardiaca grave [20]. Studi di follow-up hanno dimostrato che i pazienti con ALVD mostrano un tasso medio annuo di insufficienza cardiaca cronica dal 4,9 al 20%, con un tasso di mortalità dal 5,1 al 10,5% [21], [22]. Queste osservazioni sono state recentemente confermate in un'analisi del tasso di sopravvivenza a 5 anni che ha dimostrato un tasso di mortalità del 31% per i soggetti con ALVD e del 47% per i pazienti affetti da scompenso sistolico [23]. Infine, lo studio SOLVD ha dimostrato che il trattamento dell'ALVD può ritardare in modo significativo l'insorgenza di scompenso cardiaco [24]. Pertanto, può essere della massima importanza clinica identificare gli individui con ALVD nella popolazione generale prima che sviluppino un'insufficienza cardiaca conclamata.

C'è una scarsità di studi che hanno studiato i biomarcatori genetici specifici per i pazienti con cardiopatia ischemica (IHD) (con o senza precedente storia di infarto miocardico acuto) o pazienti DCM che hanno sostenuto una normale funzione ventricolare sinistra (stadio B), pazienti con IHD o DCM con insufficienza cardiaca sintomatica tipica (stadio C) e pazienti con IHD o DCM che progrediscono verso l'insufficienza cardiaca scompensata (stadio D). Maciejak et al, [25] hanno studiato i biomarcatori genetici di pazienti IHD con infarto miocardico acuto (AMI) che hanno sviluppato disfunzione ventricolare sinistra VS. pazienti con infarto miocardico acuto che hanno mantenuto la normale frazione di eiezione ventricolare alla stessa durata. Hanno dimostrato un profilo di espressione genica alterato nell'IMA che ha sviluppato scompenso cardiaco. Sweet et al, [26] hanno analizzato l'intero trascrittoma in pazienti con cardiomiopatia ischemica (ICM) e pazienti DCM VS pazienti sani senza storia di malattie cardiovascolari. Hanno trovato firme chiave specifiche dell'eziologia che caratterizzavano ICM e DCM. Tijsen et al, [27] hanno eseguito l'array di micro RNA in soggetti sani, pazienti con insufficienza cardiaca, pazienti con dispnea dovuta a insufficienza cardiaca e pazienti con dispnea per cause diverse dall'insufficienza cardiaca. Hanno identificato 6 miRNA che sono elevati nei pazienti con scompenso cardiaco, tra i quali il miR423-5p era più fortemente correlato alla diagnosi clinica di scompenso cardiaco. Smih F et al, [28] hanno studiato, mediante analisi di microarray, il profilo di espressione genica specifico per la disfunzione ventricolare sinistra asintomatica, vale a dire, i pazienti pre-insufficienza cardiaca. Nessuno degli studi sopra menzionati ha studiato i profili di espressione genica o le firme dei biomarcatori genetici specifici per stadi sintomatici progressivi dell'insufficienza cardiaca VS. stadio preclinico di scompenso cardiaco.

Precedenti studi di microarray hanno rivelato firme di espressione genica distinte tra eziologie HF [28-33]; ma altri non sono riusciti a trovare distinzioni [34, 35]. Il sequenziamento diretto dell'RNA (RNA-seq) fornisce anche una quantificazione accurata delle trascrizioni ed è stato utilizzato per identificare le firme di espressione tra cuori HF e non falliti (NF) [36], nuovi regolatori trascrizionali e reti di miRNA perturbate in ICM o DCM [37 , 38], trascrittomi pre e post-LVAD [39, 40], geni HF comuni nella cardiomiopatia pediatrica [41] e splicing, eQTL ed espressione allelica in DCM [42].

Ipotizziamo che la piena comprensione delle variazioni genetiche specifiche come la sovraespressione genica o la disregolazione genica in tali coorti di pazienti con IHD o DCM che progrediscono verso stadi successivi di insufficienza cardiaca VS. I pazienti con IHD o DCM che mantengono la normale funzione sistolica possono aprire la strada alla scoperta di biomarcatori genetici diagnostici di pazienti con IHD e pazienti con DCM ad alto rischio di progressione verso stadi successivi di insufficienza cardiaca. Inoltre, scoprire profili di espressione genica differenziali in soggetti con IHD e DCM in diversi stadi dell'insufficienza cardiaca può essere il primo passo per l'innovazione di nuove terapie geniche per la prevenzione della progressione dell'insufficienza cardiaca nei pazienti con IHD allo stadio B e il recupero dei pazienti con IHD a stadi progressivi di scompenso cardiaco (C e D).

B.7. Approccio e metodologia:

1. Gestione del progetto e consorzio

2. Reclutamento e assegnazione dei pazienti Il protocollo di questo studio sarà ampiamente progettato e rivisto dal comitato di revisione istituzionale dell'ospedale educativo di cardiologia dell'Università di Asyut. A tutti i pazienti verrà richiesto di firmare un consenso informato dettagliato prima del reclutamento.

   Criteri di inclusione: pazienti con IHD o DCM senza sintomi di scompenso cardiaco (stadio B), con sintomi tipici di scompenso cardiaco (stadio C) e pazienti con scompenso scompensato (stadio D).

   Criteri di esclusione: pazienti con cardiopatie strutturali diverse da IHD o DCM.

   In questo studio verranno reclutati pazienti con IHD o pazienti con DCM seguiti nell'ospedale di cardiologia educativa dell'Università di Assyut.

   Tutti i pazienti reclutati saranno sottoposti a esami di laboratorio completi e esame fisico completo da parte di almeno due cardiologi dell'ospedale. Tutti i pazienti saranno sottoposti a esame ecocardiografico per il rilevamento e la conferma della cardiopatia strutturale e misurazione accurata della frazione di eiezione per la stadiazione dell'insufficienza cardiaca.

   I pazienti reclutati saranno assegnati a uno dei gruppi di studio in base all'attuale stadio clinico dell'insufficienza cardiaca.

   Gruppo A: pazienti con IHD senza sintomi clinici di insufficienza cardiaca e funzione sistolica ventricolare sinistra normale (stadio preclinico o insufficienza cardiaca allo stadio B) Gruppo B: pazienti con IHD con sintomi clinici tipici di insufficienza cardiaca insieme a frazione di eiezione ridotta < 35% ( insufficienza cardiaca stadio C) Gruppo C: pazienti IHD con insufficienza cardiaca scompensata (insufficienza cardiaca stadio D) Gruppo D: pazienti DCM senza sintomi clinici di insufficienza cardiaca e funzione sistolica ventricolare sinistra normale (stadio preclinico o insufficienza cardiaca stadio B) Gruppo E: pazienti con DCM con sintomi clinici tipici di insufficienza cardiaca insieme a frazione di eiezione ridotta < 35% (insufficienza cardiaca stadio C) Gruppo F: pazienti con DCM con insufficienza cardiaca scompensata (insufficienza cardiaca stadio D)

   I pazienti saranno reclutati dalle cliniche di cardiologia esterne, dal dipartimento di cardiologia interno e dall'unità di terapia cardiaca intensiva dell'ospedale di cardiologia dell'Università di Assyut.

   Calcolo della dimensione del campione Calcoliamo la dimensione del campione dei pazienti IHD secondo l'equazione per la dimensione del campione del disegno descrittivo dello studio (43) basata sulla prevalenza della prevalenza totale di CHD è del 6,7% negli adulti statunitensi ≥ 20 anni di età e la prevalenza di DCM è 5-8 per 100000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Dimensione del campione Z1-α/2= Rappresenta il numero di errori standard dalla media (costante = 1,96) P= Rappresenta la proporzione della migliore ipotesi sul valore della proporzione di interesse. = prevalenza D= la precisione assoluta richiesta su entrambi i lati della proporzione, o della distanza; quanto vicino alla proporzione di interesse si desidera che sia la stima. 0,05.

   La dimensione del campione richiesta per i pazienti con IHD basata sul tasso di prevalenza di 0,067 sarà di 96 pazienti.

   La dimensione del campione richiesta per i pazienti DCM in base al tasso di prevalenza di 0,008 sarà di 11 pazienti La dimensione totale del campione (compresi i soggetti di controllo) è di 107 pazienti.

3. Biopsia cardiaca

   Il bioptomo verrà utilizzato per l'estrazione del tessuto ventricolare (biopsia). I campioni estratti saranno conservati in azoto liquido a -80 gradi Celsius.

4. Importazione di kit, prodotti chimici e materiali di consumo
5. Estrazione dell'RNA L'RNA totale sarà estratto da campioni di tessuto di pazienti con diversi stadi di insufficienza cardiaca clinica e persone sane utilizzando il kit di isolamento dell'RNA spin Spin Tempus in Tempus TM Blood RNA Tube raccomandato dalle istruzioni del produttore (Life Technologies Invitrogen, USA). (45) (Appendice A)

7- Sequenziamento dell'RNA

(piattaforma Thermofisher Ion Torrent): opzione A

L'isolamento del trascrittoma veramente completo per l'analisi di sequenziamento di nuova generazione sarà prodotto utilizzando The RiboMinus™ Eukaryote System v2 (Appendice C). Il kit Ion Total RNA-Seq v2 verrà utilizzato per la semplice costruzione di librerie di RNA (Appendice D). Il sistema Ion Chef verrà utilizzato per la preparazione del modello walk-away e il caricamento del chip (Appendice E). I sistemi Ion GeneStudio S5 saranno utilizzati per il sequenziamento di pannelli genici fino al trascrittoma (Appendice F). Il software Torrent Suite fornisce automaticamente le letture della sequenza nei formati esportabili FASTQ o BAM (Appendice G).

8- Bioinformatica e analisi dei dati

Il plug-in "RNASeqAnalysis" del software Torrent Suite verrà utilizzato per l'analisi iniziale, incluso l'allineamento e la quantificazione del trascritto dell'RNA. Utilizzeremo hg19 come genoma di riferimento umano, in cui verranno rilevati allineamenti completi e parziali utilizzando mappatori STAR e Bowtie2. Gli strumenti Picard verranno applicati per contare le letture allineate a ciascun gene, mentre il software dei gemelli verrà utilizzato per rappresentare le diverse isoforme per ciascun gene. Verranno generati grafici completi per i singoli campioni, nonché grafici che confrontano i campioni . L'ulteriore analisi specifica sarà ottenuta utilizzando script sviluppati internamente (in python o R) per il calcolo del cambiamento di piega, l'identificazione di geni / isoforme regolati verso l'alto e verso il basso e l'analisi dell'arricchimento del percorso utilizzando il software Cytoscape. L'analisi dell'arricchimento del percorso può identificare i percorsi che possono avere un ruolo nella malattia su dati di serie temporali. Applicheremo un approccio integrativo Multi-Omics per integrare e correlare i dati che abbiamo ottenuto da entrambi i tipi di dati (RNA-Seq).

9- stesura e pubblicazione di manoscritti

Ci aspettiamo che la pubblicazione di questo progetto risulti in almeno due riviste ad alto fattore di impatto nel campo della genetica molecolare e nel campo della cardiologia.

B.8. Qualifiche e competenze (max 2 pagine):

La qualifica più importante è la disponibilità di esperti di cardiologia professionale e genetica molecolare che saranno in grado di condurre rapidamente lo studio. Inoltre, nei laboratori molecolari del centro di ricerca nazionale, della fondazione Magdy Yaacoub e di molti altri laboratori molecolari privati ​​in Egitto sono disponibili strumenti estremamente costosi e fondamentali, necessari sia per la profilazione dell'espressione genica dei microarray che per il sequenziamento dell'intero torrente ionico del trascrittoma.

Le competenze più importanti sono l'alto costo dei kit, dei prodotti chimici, dei materiali di consumo e di alcuni strumenti minori che dovrebbero essere acquistati per la completa conduzione del progetto.