Genética de la miocardiopatía isquémica

B.3. Resultados e impacto:

Es un gran honor que sir Magdy yacoub haya revisado este proyecto más de una vez y es un gran honor para mí y para todo el equipo del proyecto que sir Magdy yaq. Aceptó ser el co-investigador de este proyecto, y esto realmente refleja su patriotismo y su preocupación por todo lo que sea de interés para la salud de los egipcios. Descubrir biomarcadores genéticos y firmas que tipifiquen a los pacientes con miocardiopatía isquémica y pacientes con miocardiopatía dilatada en el preclínico. etapa de insuficiencia cardiaca, etapa clínica sintomática de insuficiencia cardiaca e insuficiencia cardiaca terminal descompensada. Estos biomarcadores específicos pueden usarse mucho como biomarcadores de diagnóstico para pacientes con CI y MCD con un riesgo extremadamente alto de progresión a etapas posteriores de insuficiencia cardíaca gravemente sintomática. La detección temprana de esos pacientes puede ayudar a prevenir su progresión a etapas posteriores de insuficiencia cardíaca mediante un seguimiento estrecho y estrategias terapéuticas y no terapéuticas. Hemos tenido en cuenta que los agentes farmacológicos tradicionales utilizados para ralentizar o prevenir la progresión de pacientes con insuficiencia cardiaca típicamente sintomática -principalmente betabloqueantes e inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina- ya se prescriben a todos los pacientes con cardiopatía isquémica sin eficacia demostrada para prevenir la progresión de los mismos. pacientes con insuficiencia cardiaca típica (pacientes con disfunción ventricular izquierda). En base a la hipótesis anterior, existe una gran necesidad de nuevas terapias que puedan prevenir la progresión de los pacientes con cardiopatía estructural (insuficiencia cardíaca en etapa B) a pacientes con insuficiencia cardíaca típica y en etapa terminal (insuficiencia cardíaca en etapa C y D).

Los resultados esperados pueden explicar nuevas vías genéticas de la progresión clínica del trastorno cardíaco estructural asintomático (insuficiencia cardíaca en etapa B) a insuficiencia cardíaca típicamente sintomática (etapa C) e insuficiencia cardíaca descompensada (etapa D).

Los resultados esperados de este proyecto pueden llevarnos a la fundación novedosa de la primera base de datos egipcia de biomarcadores genéticos de diferentes etapas de insuficiencia cardíaca con CI subyacente o DCM.

La novedad de la idea y nuestro plan de utilizar las técnicas más recientes de perfiles de expresión génica y las metodologías bioinformáticas más actualizadas pueden allanar el camino para publicar los resultados de este trabajo en revistas de alto factor de impacto tanto en el campo de la genética molecular como en el campo de la cardiología.

El resultado esperado de este proyecto puede ser una referencia para muchos candidatos a maestrías y doctorados en el campo de la insuficiencia cardíaca y la genética molecular cardíaca en Egipto y en todo el mundo. La novedad de la idea, dado que, según nuestro conocimiento, no existen estudios previos que investigaran el perfil de expresión génica específica en diferentes etapas de la insuficiencia cardíaca, puede atraer una alta puntuación de citas por parte de científicos especializados en el campo.

La detección temprana de pacientes con cardiopatía estructural asintomática con alto riesgo de desarrollo de etapas progresivas de insuficiencia cardíaca puede ayudar a prevenir su progresión mediante estrategias farmacológicas y no farmacológicas. Esto puede contribuir a ahorrar una gran cantidad de dinero del gobierno gastado en la atención y el tratamiento de aquellos pacientes en etapas severamente sintomáticas de insuficiencia cardíaca descompensada.

El plan de los investigadores es seguir utilizando la información que se revelará en este proyecto para aplicar las técnicas investigadas más recientemente de activación y represión de ARN para tratar la sobreexpresión génica y la desregulación génica en pacientes que sufren etapas progresivas de insuficiencia cardíaca SV. aquellos en etapas asintomáticas primarias de insuficiencia cardíaca para allanar el camino para la innovadora terapia génica novedosa para la prevención de la progresión de las etapas primarias a las etapas progresivas de insuficiencia cardíaca y la recuperación de los pacientes con insuficiencia cardíaca en etapa terminal a las etapas de estilo de vida normales asintomáticos estables de la enfermedad. Esta nueva terapia no solo contribuirá a mitigar la miseria de un número tan grande de egipcios que padecen esta enfermedad tan incapacitante, sino que también será un avance científico revolucionario en el campo de la terapia génica en todo el mundo. Estamos llenos de fe de que somos los egipcios que podemos hacer milagros con paciencia, determinación, lucha y fe en nuestro sueño.

B.4. Vanguardia y excelencia:

La insuficiencia cardíaca (IC) afecta a unos 6,5 millones de estadounidenses adultos [1]. Aunque las tasas de supervivencia aumentaron un 10 % entre 1979 y 2000, la tasa actual de mortalidad a 5 años sigue siendo de alrededor del 50 % [1, 2]. Un paradigma de larga data es que la insuficiencia cardíaca terminal con fracción de eyección reducida (HFrEF) evoluciona a través de una "vía común final" a pesar de tener una amplia variedad de etiologías y contribuciones genéticas [3, 4]. Los resultados de los ensayos clínicos y las guías actuales para el manejo de la HFrEF confirman este punto de vista y dirigen la terapia basada principalmente en el grado de fracción de eyección del ventrículo izquierdo y la gravedad clínica usando la clasificación de la New York Heart Association (NYHA) [5].

La cardiopatía isquémica (IHD) es la causa de muerte más común a nivel mundial según los informes de la OMS y es la principal causa de insuficiencia cardíaca en los países desarrollados [6-9]. Se ha encontrado que la insuficiencia cardíaca secundaria a CI se asocia de forma independiente con tasas de mortalidad más altas en comparación con una etiología no isquémica [10, 11]. El aumento de la incidencia se ha atribuido a la alta eficacia de la intervención coronaria percutánea primaria y trombolítica en el tratamiento de infartos agudos de miocardio, lo que conduce a una mejor supervivencia del paciente, aunque a menudo conduce a una mayor morbilidad debido a la remodelación del ventrículo izquierdo (VI) y a la insuficiencia ventricular izquierda crónica. disfunción. El término miocardiopatía isquémica (MCI) se ha definido como disfunción sistólica del VI con uno o más de los siguientes: antecedentes de revascularización miocárdica previa o infarto de miocardio, estenosis de más del 75 % en el tronco principal izquierdo o en la arteria descendente anterior izquierda, o dos vasos o más con una estenosis superior al 75% [12].

Una de las causas más comunes de insuficiencia cardíaca son las miocardiopatías. La American Heart Association describió las miocardiopatías como un grupo heterogéneo de enfermedades del miocardio que son predominantemente genéticas y se asocian con disfunción mecánica y/o eléctrica [13]. La MCD se caracteriza por la presencia de dilatación ventricular izquierda o biventricular y disfunción sistólica en ausencia de condiciones de carga anormales. Es la segunda causa más común de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida. La DCM es un trastorno complejo con diversas variantes genéticas y factores ambientales que determinan el inicio y el curso de la enfermedad [14, 15].

La cardiopatía isquémica y las miocardiopatías inducen la modificación de la estructura del miocardio y pueden conducir a alteraciones de la función cardíaca [16], incluida una reducción de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI). La identificación de pacientes en etapa de "pre-insuficiencia cardíaca" puede prevenir el desarrollo de IC mediante la implementación de estrategias médicas y no médicas adaptadas. Este estado preclínico silencioso (preinsuficiencia cardíaca) se denomina disfunción ventricular izquierda asintomática (ALVD) y solo puede discriminarse mediante ecocardiografía transtorácica. ALVD, común en la población general, conduce a un alto riesgo de desarrollar insuficiencia cardíaca manifiesta. De hecho, los sujetos ALVD tienen un aumento de 12 veces en la tasa anual de hospitalización por IC de primer evento en comparación con los individuos con FEVI normal [17] y un aumento de 4 veces en el riesgo de muerte durante un período de 6 años [16]. . La detección eficaz a gran escala de ALVD, que representa un importante desafío clínico no resuelto, requiere la determinación de biomarcadores de ALVD.

La detección de ALVD ha comenzado hace más de una década [17], [18]. Sin embargo, no hay biomarcadores ALVD. De hecho, el diagnóstico de ALVD justifica un análisis ecocardiográfico complicado, que requiere mucho tiempo, es costoso y no es aplicable a la gran población de personas en riesgo. La falta de biomarcadores puede ser de gran importancia porque la ALVD es muy prevalente debido al aumento general de los factores de riesgo cardiovascular [19]. ALVD se ha establecido como un indicador predictivo temprano de IC grave [20]. Los estudios de seguimiento han demostrado que los pacientes con ALVD muestran una tasa anual promedio de insuficiencia cardíaca crónica de 4,9 a 20 %, con una tasa de mortalidad de 5,1 a 10,5 % [21], [22]. Estas observaciones se confirmaron recientemente en un análisis de tasa de supervivencia a 5 años que demostró una tasa de mortalidad del 31 % para sujetos con ALVD y del 47 % para pacientes que sufrían insuficiencia cardíaca sistólica [23]. Finalmente, el estudio SOLVD demostró que el tratamiento de ALVD puede retrasar significativamente la aparición de IC [24]. Por lo tanto, puede ser de suma importancia clínica identificar a los individuos con ALVD en la población general antes de que desarrollen insuficiencia cardíaca manifiesta.

Hay una escasez de ensayos que investigaron los biomarcadores genéticos específicos para pacientes con cardiopatía isquémica (IHD) (con o sin antecedentes de infarto agudo de miocardio) o pacientes con DCM que mantuvieron una función ventricular izquierda normal (estadio B), pacientes con IHD o DCM con insuficiencia cardíaca sintomática típica (etapa C) y pacientes con IHD o DCM que progresan a insuficiencia cardíaca descompensada (etapa D). Maciejak et al, [25] investigaron los biomarcadores genéticos de pacientes con cardiopatía isquémica con infarto agudo de miocardio (IAM) que desarrollaron disfunción ventricular izquierda SV. pacientes con infarto agudo de miocardio que mantuvieron la fracción de eyección ventricular normal al mismo tiempo. Demostraron un perfil de expresión génica alterado en AMI que desarrolló HF. Sweet et al, [26] analizaron el transcriptoma completo en pacientes con miocardiopatía isquémica (ICM) y pacientes con DCM versus pacientes sanos sin antecedentes de enfermedades cardiovasculares. Encontraron firmas específicas de etiología clave que tipificaban ICM y DCM. Tijsen et al, [27] realizaron una matriz de microARN en sujetos sanos, pacientes con insuficiencia cardíaca, pacientes con disnea debida a insuficiencia cardíaca y pacientes con disnea por causas distintas a la insuficiencia cardíaca. Identificaron 6 miARN que están elevados en pacientes con IC, entre los cuales miR423-5p se relacionó más fuertemente con el diagnóstico clínico de IC. Smih F et al, [28] investigaron, mediante análisis de micromatrices, el perfil de expresión génica específica para la disfunción ventricular izquierda asintomática, es decir, pacientes con preinsuficiencia cardíaca. Ninguno de los ensayos mencionados anteriormente investigó los perfiles de expresión génica o las firmas de biomarcadores genéticos específicos para las etapas sintomáticas progresivas de la insuficiencia cardíaca SV. etapa preclínica de insuficiencia cardíaca.

Estudios previos de micromatrices revelaron distintas firmas de expresión génica entre las etiologías de IC [28-33]; pero otros no lograron encontrar distinciones [34, 35]. La secuenciación directa de ARN (RNA-seq) también proporciona una cuantificación precisa de las transcripciones y se ha utilizado para identificar firmas de expresión entre corazones HF y corazones que no fallan (NF) [36], nuevos reguladores transcripcionales y redes de miARN perturbadas en ICM o DCM [37 , 38], transcriptomas pre y post-LVAD [39, 40], genes HF comunes en la miocardiopatía pediátrica [41] y empalme, eQTL y expresión alélica en DCM [42].

Nuestra hipótesis es que la comprensión completa de las variaciones genéticas específicas, como la sobreexpresión de genes o la desregulación de genes en tales cohortes de pacientes con CI o DCM que progresan a etapas posteriores de insuficiencia cardíaca SV. Los pacientes con CI o MCD que retienen una función sistólica normal pueden allanar el camino para descubrir biomarcadores genéticos de diagnóstico de pacientes con CI y pacientes con MCD con alto riesgo de progresión a etapas posteriores de insuficiencia cardíaca. Además, descubrir perfiles de expresión génica diferencial en sujetos con CI y MCD en diferentes etapas de insuficiencia cardíaca puede ser el primer paso para la innovación de nuevas terapias génicas para la prevención de la progresión de la insuficiencia cardíaca en pacientes con CI en etapa B y la recuperación de pacientes con CI en etapa B. etapas progresivas de insuficiencia cardiaca (C y D).

B.7. Enfoque y Metodología:

1. Gestión de proyectos y consorcio

2. Reclutamiento y asignación de pacientes El protocolo de este estudio será ampliamente diseñado y revisado por la junta de revisión institucional del hospital de cardiología educativa de la Universidad de Asyut. Se solicitará a todos los pacientes que firmen un consentimiento informado detallado antes del reclutamiento.

   Criterios de inclusión: pacientes con CI o MCD sin síntomas de IC (estadio B), con síntomas típicos de IC (estadio C) y pacientes con IC descompensada (estadio D).

   Criterios de exclusión: Pacientes con cardiopatías estructurales distintas de la CI o la MCD.

   En este estudio se reclutarán pacientes con IHD o pacientes con DCM seguidos en el hospital de cardiología educativa de la Universidad de Assyut.

   Todos los pacientes reclutados se someterán a exámenes de laboratorio completos y un examen físico completo por parte de al menos dos cardiólogos en el hospital. Todos los pacientes se someterán a un examen ecocardiográfico para la detección y confirmación de enfermedades cardíacas estructurales y una medición precisa de la fracción de eyección para la estadificación de la insuficiencia cardíaca.

   Los pacientes reclutados se asignarán a uno de los grupos de estudio según el estadio clínico actual de la insuficiencia cardíaca.

   Grupo A: pacientes con cardiopatía isquémica sin síntomas clínicos de insuficiencia cardíaca y función sistólica ventricular izquierda normal (insuficiencia cardíaca en estadio preclínico o estadio B) Grupo B: pacientes con cardiopatía isquémica con síntomas clínicos típicos de insuficiencia cardíaca junto con fracción de eyección reducida < 35 % ( (insuficiencia cardíaca en estadio C) Grupo C: pacientes con CI con insuficiencia cardíaca descompensada (insuficiencia cardíaca en estadio D) Grupo D: pacientes con DCM sin síntomas clínicos de insuficiencia cardíaca y función sistólica ventricular izquierda normal (insuficiencia cardíaca en estadio preclínico o estadio B) Grupo E: pacientes con MCD con síntomas clínicos típicos de insuficiencia cardíaca junto con una fracción de eyección reducida < 35 % (insuficiencia cardíaca en estadio C) Grupo F: pacientes con MCD con insuficiencia cardíaca descompensada (insuficiencia cardíaca en estadio D)

   Los pacientes serán reclutados de las clínicas de cardiología externa, el departamento de cardiología interna y la unidad de cuidados cardíacos intensivos del Hospital de Cardiología docente de la Universidad de Assyut.

   Cálculo del tamaño de la muestra Calculamos el tamaño de la muestra de los pacientes con cardiopatía isquémica de acuerdo con la ecuación para el tamaño de la muestra del diseño de estudio descriptivo (43) basado en la prevalencia de la prevalencia de la cardiopatía coronaria total es del 6,7 % en adultos de EE. UU. ≥ 20 años de edad y la prevalencia de la MCD es 5-8 por 100000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Tamaño de la muestra Z1-α/2= Representa el número de errores estándar de la media (constante = 1,96) P= Representa la proporción de la mejor conjetura sobre el valor de la proporción de interés. = prevalencia D= la precisión absoluta requerida en cualquier lado de la proporción o la distancia; qué tan cerca de la proporción de interés se desea que esté la estimación. 0.05.

   El tamaño de muestra necesario para los pacientes con cardiopatía isquémica basado en la tasa de prevalencia de 0,067 será de 96 pacientes.

   El tamaño de muestra necesario para los pacientes con DCM basado en la tasa de prevalencia de 0,008 será de 11 pacientes. El tamaño total de la muestra (incluidos los sujetos de control) es de 107 pacientes.

3. Biopsia cardiaca

   Bioptome se utilizará para la extracción de tejido ventricular (biopsia). Los especímenes extraídos serán reservados en nitrógeno líquido a -80 grados centígrados.

4. Importación de kits, químicos y consumibles
5. Extracción de ARN El ARN total se extraerá de muestras de tejido de pacientes con diferentes estadios clínicos de insuficiencia cardiaca y de personas sanas utilizando el Tempus TM spin RNA Isolation Kit en Tempus TM Blood RNA Tube recomendado por las instrucciones del fabricante (Life Technologies Invitrogen, EE. UU.). (45) (Apéndice A)

7- Secuenciación de ARN

(Plataforma Thermofisher Ion Torrent): opción A

Se producirá un aislamiento del transcriptoma verdaderamente completo para el análisis de secuenciación de próxima generación utilizando The RiboMinus™ Eukaryote System v2 (Apéndice C). El Ion Total RNA-Seq Kit v2 se utilizará para la construcción de bibliotecas de ARN simples (Apéndice D). El sistema Ion Chef se utilizará para la preparación de plantillas y la carga de chips (Apéndice E). Los sistemas Ion GeneStudio S5 se utilizarán para la secuenciación de paneles de genes hasta el transcriptoma (Apéndice F). Torrent Suite Software proporciona automáticamente las lecturas de secuencia en formatos FASTQ o BAM exportables (Apéndice G).

8- Bioinformática y análisis de datos

El complemento "RNASeqAnalysis" del software Torrent Suite se empleará para el análisis inicial, incluida la alineación y cuantificación de la transcripción de ARN. Usaremos hg19 como un genoma de referencia humano, donde se detectarán alineaciones completas y parciales usando mapeadores STAR y Bowtie2. Las herramientas de Picard se aplicarán para contar las lecturas alineadas con cada gen, mientras que el software de gemelos se utilizará para representar diferentes isoformas para cada gen. Se generarán gráficos completos para muestras individuales, así como gráficos de comparación de muestras. El análisis específico adicional se logrará utilizando scripts desarrollados internamente (en python o R) para el cálculo del cambio de pliegue, identificando genes/isoformas regulados hacia arriba y hacia abajo y análisis de enriquecimiento de vías utilizando el software Cytoscape. El análisis de enriquecimiento de vías puede identificar vías que pueden tener un papel en la enfermedad en una serie de datos de tiempo. Aplicaremos un enfoque integrador Multi-Omics para integrar y correlacionar los datos que obtuvimos de ambos tipos de datos (RNA-Seq).

9- redacción y publicación de manuscritos

Esperamos que la publicación de este proyecto resulte en al menos dos revistas de alto factor de impacto en el campo de la genética molecular y el campo de la cardiología.

B.8. Cualificaciones y competencias (máximo 2 páginas):

La calificación más importante es la disponibilidad de expertos profesionales en cardiología y genética molecular que puedan realizar el estudio de manera expedita. Además, en los laboratorios moleculares del centro nacional de investigación, la fundación Magdy Yaacoub y muchos otros laboratorios moleculares privados en Egipto, se encuentran disponibles instrumentos fundamentalmente críticos y muy costosos necesarios tanto para el perfilado de expresión génica de micromatrices como para la secuenciación de ARN de torrente de iones de transcriptoma completo.

Las competencias más importantes son el alto costo de los kits, químicos, consumibles y algunos instrumentos menores que se deben adquirir para la realización completa del proyecto.