Генетика ишемической кардиомиопатии

Б.3. Результаты и влияние:

Для меня большая честь, что сэр Магди Якуб неоднократно пересматривал этот проект, и для меня и всей команды проекта большая честь, что сэр Магди Як. Принят в качестве соисследователя этого проекта, и это действительно отражает его патриотизм и его заботу обо всем, что в интересах здоровья египтян. Выявление генетических биомаркеров и сигнатур, которые типичны для пациентов с ишемической кардиомиопатией и пациентов с дилатационной кардиомиопатией в доклинических исследованиях. стадия сердечной недостаточности, симптоматическая клиническая стадия сердечной недостаточности и декомпенсированная терминальная стадия сердечной недостаточности. Эти специфические биомаркеры могут широко использоваться в качестве диагностических биомаркеров для пациентов с ИБС и ДКМП с чрезвычайно высоким риском прогрессирования до более поздних тяжелосимптомных стадий сердечной недостаточности. Ранний скрининг таких пациентов может помочь предотвратить их прогрессирование до более поздних стадий сердечной недостаточности за счет тщательного мониторинга и терапевтических и нетерапевтических стратегий. Мы принимаем во внимание, что традиционные фармакологические средства, используемые для замедления или предотвращения прогрессирования у пациентов с типично симптоматической сердечной недостаточностью, в основном бета-блокаторы и ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, уже назначаются всем больным ИБС без доказанной эффективности для предотвращения прогрессирования этих заболеваний. пациентов с типичной сердечной недостаточностью (пациенты с дисфункцией левого желудочка). Основываясь на приведенной выше гипотезе, существует большая потребность в новых методах лечения, которые могут предотвратить прогрессирование пациентов со структурными заболеваниями сердца (сердечная недостаточность стадии B) до пациентов с типичной и конечной стадией сердечной недостаточности (сердечная недостаточность стадии C и D).

Ожидаемые результаты могут объяснить новые генетические пути клинического прогрессирования бессимптомного структурного заболевания сердца (стадия B) до типично симптоматической сердечной недостаточности (стадия C) и декомпенсированной сердечной недостаточности (стадия D).

Ожидаемые результаты этого проекта могут привести нас к новой основе первой египетской базы данных генетических биомаркеров различных стадий сердечной недостаточности с лежащей в основе ИБС или ДКМП.

Новизна идеи и наш план использовать самые последние методы профилирования экспрессии генов и самые современные методологии биоинформатики могут проложить путь к публикации результатов этой работы в журнале с высоким импакт-фактором как в области молекулярной генетики, так и в области кардиологии.

Ожидаемый результат этого проекта может стать ориентиром для многих соискателей степени магистра и доктора наук в области сердечной недостаточности и молекулярной генетики сердца в Египте и во всем мире. Новизна идеи, учитывая, что, насколько нам известно, ранее не проводилось исследований, в которых изучалось профилирование специфической экспрессии генов на разных стадиях сердечной недостаточности, может привлечь высокие баллы цитирования со стороны профильных ученых в этой области.

Ранний скрининг пациентов с бессимптомным структурным заболеванием сердца с высоким риском развития прогрессирующих стадий сердечной недостаточности может помочь предотвратить их прогрессирование с помощью фармакологических и немедикаментозных стратегий. Это может способствовать экономии огромных сумм государственных средств, расходуемых на уход и лечение пациентов с тяжелой симптоматической декомпенсированной стадией сердечной недостаточности.

План исследователей состоит в том, чтобы в дальнейшем использовать информацию, которая будет раскрыта в этом проекте, для применения самых последних исследованных методов активации и репрессии РНК для лечения сверхэкспрессии генов и дисрегуляции генов у пациентов, страдающих прогрессирующими стадиями сердечной недостаточности VS. пациентов с начальной бессимптомной стадией сердечной недостаточности, чтобы проложить путь для инновационной новой генной терапии для предотвращения прогрессирования сердечной недостаточности от начальной стадии к прогрессирующей стадии и восстановления пациентов с конечной стадией сердечной недостаточности до стабильных бессимптомных стадий нормального образа жизни. болезнь. Эта новая терапия не только будет способствовать облегчению страданий огромного числа египтян, страдающих от этой серьезно инвалидизирующей болезни, но и станет научным революционным прорывом в области генной терапии во всем мире. Мы полны веры в то, что мы, египтяне, можем творить чудеса благодаря терпению, решительности, борьбе и вере в свою мечту.

Б.4. Современность и превосходство:

Сердечная недостаточность (СН) затрагивает приблизительно 6,5 миллионов взрослых американцев [1]. Хотя показатели выживаемости увеличились на 10% в период с 1979 по 2000 год, текущий уровень 5-летней смертности по-прежнему составляет около 50% [1, 2]. Давняя парадигма состоит в том, что терминальная стадия сердечной недостаточности со сниженной фракцией выброса (HFrEF) развивается по «конечному общему пути», несмотря на большое разнообразие этиологии и генетического вклада [3, 4]. Результаты клинических испытаний и текущие рекомендации по лечению СНнФВ подтверждают эту точку зрения и направляют терапию, основанную главным образом на степени фракции выброса левого желудочка и клинической тяжести с использованием классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) [5].

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) является наиболее частой причиной смерти в мире по данным ВОЗ и ведущей причиной сердечной недостаточности в развитых странах [6-9]. Было обнаружено, что сердечная недостаточность, вторичная по отношению к ИБС, независимо связана с более высокими показателями смертности по сравнению с неишемической этиологией [10, 11]. Увеличение заболеваемости связано с высокой эффективностью тромболитических и первичных чрескожных коронарных вмешательств при лечении острых инфарктов миокарда, что приводит к улучшению выживаемости пациентов, однако часто приводит к увеличению заболеваемости из-за ремоделирования левого желудочка (ЛЖ) и хронического поражения левого желудочка. дисфункция. Термин «ишемическая кардиомиопатия» (ИКМ) определяется как систолическая дисфункция ЛЖ с одним или несколькими из следующих признаков: предшествующая реваскуляризация миокарда или инфаркт миокарда, стеноз более 75% в стволе левой стволовой или левой передней нисходящей артерии или два сосуды или более со стенозом более 75% [12].

Одной из наиболее частых причин сердечной недостаточности являются кардиомиопатии. Американская кардиологическая ассоциация описала кардиомиопатии как гетерогенную группу заболеваний миокарда, которые являются преимущественно генетическими и связаны с механической и/или электрической дисфункцией [13]. ДКМП характеризуется наличием левожелудочковой или бивентрикулярной дилатации и систолической дисфункцией при отсутствии аномальных условий нагрузки. Это вторая по распространенности причина сердечной недостаточности со сниженной фракцией выброса. ДКМП представляет собой сложное заболевание с разнообразными генетическими вариантами и факторами окружающей среды, определяющими начало и течение заболевания [14, 15].

ИБС и кардиомиопатии индуцируют модификацию структуры миокарда и могут приводить к изменениям функции сердца [16], включая снижение фракции выброса левого желудочка (ФВЛЖ). Выявление больных на стадии «до сердечной недостаточности» может предотвратить развитие СН за счет реализации адаптированных лечебных и немедикаментозных стратегий. Это бессимптомное доклиническое состояние (предсердечная недостаточность) называется бессимптомной дисфункцией левого желудочка (ALVD) и может быть распознано только с помощью трансторакальной эхокардиографии. ALVD, распространенный в общей популяции, приводит к высокому риску развития манифестной СН. Действительно, у пациентов с ALVD ежегодная частота госпитализаций по поводу первой сердечной недостаточности увеличивается в 12 раз по сравнению с лицами с нормальной ФВ ЛЖ [17] и в 4 раза увеличивается риск смерти в течение 6-летнего периода [16]. . Эффективный крупномасштабный скрининг на ALVD, представляющий собой серьезную нерешенную клиническую проблему, требует определения биомаркеров ALVD.

Скрининг на ALVD начался более десяти лет [17], [18]. Однако биомаркеров ALVD нет. Действительно, диагностика АЛЖ требует сложного эхокардиографического анализа, который занимает много времени, является дорогостоящим и не применим к большой популяции лиц, входящих в группу риска. Отсутствие биомаркера(ов) может иметь большое значение, поскольку ЗБЛЖ широко распространена из-за общего увеличения сердечно-сосудистых факторов риска [19]. АЛЖП была установлена ​​как прогностический ранний индикатор тяжелой СН [20]. Последующие исследования показали, что у пациентов с ALVD среднегодовая частота хронической сердечной недостаточности составляет от 4,9 до 20% с уровнем смертности от 5,1 до 10,5% [21], [22]. Эти наблюдения были недавно подтверждены в анализе 5-летней выживаемости, который продемонстрировал смертность 31% для пациентов с ALVD и 47% для пациентов, страдающих систолической СН [23]. Наконец, исследование SOLVD продемонстрировало, что лечение ALVD может значительно отсрочить возникновение СН [24]. Таким образом, может иметь огромное клиническое значение выявление лиц с ЗБЛЖ в общей популяции до того, как у них разовьется явная СН.

Недостаточно исследований, в которых изучались генетические биомаркеры, специфичные для пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) (с или без предшествующего острого инфаркта миокарда) или пациентов с ДКМП, у которых сохранялась нормальная функция левого желудочка (стадия В), пациентов с ИБС или ДКМП. с типичной симптоматической сердечной недостаточностью (стадия С) и больными ИБС или ДКМП, у которых прогрессирует декомпенсация сердечной недостаточности (стадия D). Maciejak и соавт. [25] исследовали генетические биомаркеры больных ИБС с острым инфарктом миокарда (ОИМ), у которых развилась дисфункция левого желудочка ВС. больных острым инфарктом миокарда, у которых сохранялась нормальная фракция выброса желудочков при той же продолжительности. Они продемонстрировали измененный профиль экспрессии генов при ОИМ, у которых развилась СН. Sweet и соавторы [26] проанализировали весь транскриптом пациентов с ишемической кардиомиопатией (ИКМ) и пациентов с ДКМП по сравнению со здоровыми пациентами без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе. Они обнаружили ключевые характерные для этиологии сигнатуры, типичные для ICM и DCM. Tijsen et al. [27] выполнили массив микроРНК у здоровых людей, пациентов с сердечной недостаточностью, пациентов с одышкой из-за сердечной недостаточности и пациентов с одышкой по причинам, отличным от сердечной недостаточности. Они идентифицировали 6 miRNAs, уровень которых повышен у пациентов с HF, среди которых miR423-5p была наиболее тесно связана с клиническим диагнозом HF. Smih F и соавторы [28] исследовали с помощью микрочипового анализа специфический профиль экспрессии генов для бессимптомной дисфункции левого желудочка, а именно у пациентов до сердечной недостаточности. Ни в одном из вышеупомянутых испытаний не изучались профили экспрессии генов или сигнатуры генетических биомаркеров, специфичные для прогрессирующих симптоматических стадий сердечной недостаточности ВС. доклиническая стадия сердечной недостаточности.

Предыдущие исследования микрочипов выявили различные сигнатуры экспрессии генов между этиологиями HF [28-33]; но другим не удалось найти различий [34, 35]. Прямое секвенирование РНК (RNA-seq) также обеспечивает точную количественную оценку транскриптов и использовалось для выявления сигнатур экспрессии между HF и нормальным (NF) сердцем [36], новых регуляторов транскрипции и нарушенных сетей микроРНК в ICM или DCM [37]. , 38], транскриптомы до и после LVAD [39, 40], общие гены HF при детской кардиомиопатии [41], а также сплайсинг, eQTL и экспрессия аллелей при DCM [42].

Мы предполагаем, что полное понимание специфических генетических вариаций, таких как гиперэкспрессия генов или дисрегуляция генов, в таких когортах пациентов с ИБС или ДКМП, которые прогрессируют до более поздних стадий сердечной недостаточности VS. Пациенты с ИБС или ДКМП, сохраняющие нормальную систолическую функцию, могут проложить путь к выявлению диагностических генетических биомаркеров больных ИБС и пациентов с ДКМП с высоким риском прогрессирования сердечной недостаточности в более поздние стадии. Более того, выявление дифференциальных профилей экспрессии генов у больных ИБС и ДКМП на разных стадиях сердечной недостаточности может стать первым шагом к созданию новых генных терапий для предотвращения прогрессирования сердечной недостаточности у больных ИБС на стадии В и выздоровления больных ИБС на стадии В. прогрессирующие стадии сердечной недостаточности (С и D).

Б.7. Подход и методология:

1. Управление проектом и консорциум

2. Набор и распределение пациентов. Протокол этого исследования будет тщательно разработан и рассмотрен институциональным наблюдательным советом образовательной кардиологической больницы Университета Асьют. Всем пациентам будет предложено подписать подробное информированное согласие перед набором.

   Критерии включения: больные ИБС или ДКМП без симптомов СН (стадия В), с типичными симптомами СН (стадия С) и больные с декомпенсацией СН (стадия D).

   Критерии исключения: пациенты со структурными заболеваниями сердца, кроме ИБС или ДКМП.

   В исследование будут включены пациенты с ИБС или пациенты с ДКМП, находящиеся под наблюдением в образовательной кардиологической больнице Университета Асют.

   Все набранные пациенты пройдут полное лабораторное обследование и полное физическое обследование у не менее чем двух кардиологов в больнице. Всем пациентам будет проведено эхокардиографическое обследование для выявления и подтверждения структурных заболеваний сердца и точного измерения фракции выброса для определения стадии сердечной недостаточности.

   Набранные пациенты будут распределены в одну из групп исследования в соответствии с текущей клинической стадией сердечной недостаточности.

   Группа А: больные ИБС без клинических симптомов сердечной недостаточности и нормальной систолической функцией левого желудочка (доклиническая стадия или стадия В сердечной недостаточности) Группа Б: больные ИБС с типичными клиническими симптомами сердечной недостаточности в сочетании со сниженной фракцией выброса <35% сердечная недостаточность стадии C) Группа C: больные ИБС с декомпенсированной сердечной недостаточностью (стадия D сердечная недостаточность) Группа D: больные ДКМП без клинических симптомов сердечной недостаточности и нормальной систолической функцией левого желудочка (доклиническая стадия или стадия B сердечной недостаточности) Группа E: пациенты с ДКМП с типичными клиническими симптомами сердечной недостаточности в сочетании со сниженной фракцией выброса < 35% (стадия С сердечной недостаточности) Группа F: пациенты с ДКМП с декомпенсированной сердечной недостаточностью (стадия D сердечной недостаточности)

   Пациенты будут набраны из клиник внешней кардиологии, отделения внутренней кардиологии и отделения интенсивной терапии кардиологической больницы Университета Асют.

   Расчет размера выборки Мы рассчитываем размер выборки пациентов с ИБС в соответствии с уравнением для размера выборки описательного дизайна исследования (43) на основе распространенности Общая распространенность ИБС составляет 6,7% у взрослых в США ≥ 20 лет и распространенность ДКМП. составляет 5-8 на 100000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Размер выборки Z1-α/2= Представляет количество стандартных ошибок от среднего (константа = 1,96) P = представляет долю наилучшего предположения о значении процентной доли. = преобладание D = требуется абсолютная точность с обеих сторон пропорции или расстояния; насколько близкой к процентной доле должна быть оценка. 0,05.

   Объем выборки, необходимый для больных ИБС, исходя из коэффициента распространенности 0,067, составит 96 пациентов.

   Размер выборки, необходимый для пациентов с ДКМП, исходя из коэффициента распространенности 0,008, будет составлять 11 пациентов. Общий размер выборки (включая контрольных субъектов) составляет 107 пациентов.

3. Биопсия сердца

   Биоптом будет использоваться для извлечения ткани желудочка (биопсии). Извлеченные образцы будут храниться в жидком азоте при температуре -80 градусов Цельсия.

4. Импорт комплектов, химикатов и расходных материалов
5. Выделение РНК Тотальную РНК будут выделять из образцов тканей пациентов с различными клиническими стадиями сердечной недостаточности и здоровых людей с помощью набора для выделения РНК Tempus TM spin RNA Isolation Kit в пробирке Tempus TM Blood RNA, рекомендованной инструкцией производителя (Life Technologies Invitrogen, США). (45) (Приложение А)

7- секвенирование РНК

(платформа Thermofisher Ion Torrent): вариант А

По-настоящему полное выделение транскриптома для секвенирования следующего поколения будет производиться с использованием системы RiboMinus™ Eukaryote System v2 (Приложение C). Набор Ion Total RNA-Seq v2 будет использоваться для создания простой библиотеки РНК (Приложение D). Система Ion Chef будет использоваться для подготовки шаблона и загрузки чипа (Приложение E). Системы Ion GeneStudio S5 будут использоваться для секвенирования панелей генов вплоть до транскриптома (Приложение F). Программное обеспечение Torrent Suite автоматически обеспечивает чтение последовательности в экспортируемых форматах FASTQ или BAM (Приложение G).

8- Биоинформатика и анализ данных

Плагин Torrent Suite Software «RNASeqAnalysis» будет использоваться для начального анализа, включая выравнивание транскриптов РНК и количественную оценку. Мы будем использовать hg19 в качестве эталонного генома человека, где полное и частичное выравнивание будет обнаружено с использованием картографов STAR и Bowtie2. Инструменты Picard будут применяться для подсчета прочтений, связанных с каждым геном, тогда как программное обеспечение Cufflinks будет использоваться для представления различных изоформ для каждого гена. Для отдельных образцов будут созданы комплексные графики, а также графики сравнения образцов. Дальнейший конкретный анализ будет выполняться с использованием собственных разработанных скриптов (на языке python или R) для расчета кратности изменений, выявления генов/изоформ с повышающей и понижающей регуляцией и анализа обогащения путей с использованием программного обеспечения Cytoscape. Анализ обогащения путей может идентифицировать пути, которые могут играть роль в заболевании, по данным временного ряда. Мы будем применять интегративный подход Multi-Omics для интеграции и сопоставления данных, полученных нами из обоих типов данных (RNA-Seq).

9- написание и публикация рукописи

Мы ожидаем, что публикация этого проекта будет опубликована как минимум в двух журналах с высоким импакт-фактором в области молекулярной генетики и кардиологии.

Б.8. Квалификации и компетенции (максимум 2 страницы):

Важнейшей квалификацией является наличие профессиональных специалистов в области кардиологии и молекулярной генетики, которые смогут оперативно провести исследование. Кроме того, в молекулярных лабораториях национального исследовательского центра, фонда Магди Якуб и многих других частных молекулярных лабораториях в Египте доступны очень дорогие фундаментально важные инструменты, необходимые как для профилирования экспрессии генов микрочипов, так и для секвенирования РНК всего транскриптома.

Наиболее важными компетенциями являются высокая стоимость комплектов, химикатов, расходных материалов и некоторых второстепенных инструментов, которые необходимо приобрести для полного ведения проекта.