Genetik der ischämischen Kardiomyopathie

B.3. Ergebnisse und Auswirkungen:

Es ist eine große Ehre, dass Sir Magdy Yacoub dieses Projekt mehr als einmal überarbeitet hat, und es ist eine große Ehre für mich und das gesamte Team des Projekts, dass er Sir Magdy Yaq ist. Akzeptiert als Mitforscher dieses Projekts, und dies spiegelt wirklich seinen Patriotismus und seine Sorge um alles wider, was im Interesse der Gesundheit der Ägypter ist. Erforschung genetischer Biomarker und Signaturen, die typisch für Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie und Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie in der Vorklinik sind Stadium der Herzinsuffizienz, symptomatisches klinisches Stadium der Herzinsuffizienz und dekompensierte Herzinsuffizienz im Endstadium. Diese spezifischen Biomarker können in hohem Maße als diagnostische Biomarker für IHD- und DCM-Patienten mit einem extrem hohen Risiko für das Fortschreiten zu späteren schwer symptomatischen Stadien der Herzinsuffizienz verwendet werden. Das frühzeitige Screening dieser Patienten kann dazu beitragen, ihr Fortschreiten zu späteren Stadien der Herzinsuffizienz durch engmaschige Überwachung und therapeutische und nicht-therapeutische Strategien zu verhindern. Wir berücksichtigen, dass die traditionellen pharmakologischen Mittel, die verwendet werden, um das Fortschreiten von Patienten mit typischer symptomatischer Herzinsuffizienz zu verlangsamen oder zu verhindern – hauptsächlich Betablocker und Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer – bereits allen IHD-Patienten ohne nachgewiesene Wirksamkeit zur Verhinderung des Fortschreitens dieser Patienten verschrieben werden Patienten zu typischen Patienten mit Herzinsuffizienz (Patienten mit linksventrikulärer Dysfunktion). Basierend auf der obigen Hypothese besteht ein großer Bedarf an neuen Therapien, die das Fortschreiten von Patienten mit struktureller Herzerkrankung (Herzinsuffizienz im Stadium B) zu Patienten mit typischer Herzinsuffizienz und im Endstadium (Herzinsuffizienz im Stadium C und D) verhindern können.

Die erwarteten Ergebnisse könnten neue genetische Wege des klinischen Fortschreitens einer asymptomatischen strukturellen Herzinsuffizienz (Herzinsuffizienz im Stadium B) zu einer typisch symptomatischen Herzinsuffizienz (Stadium C) und einer dekompensierten Herzinsuffizienz (Stadium D) erklären.

Die erwarteten Ergebnisse dieses Projekts können uns zur neuartigen Gründung der ersten ägyptischen Datenbank der genetischen Biomarker verschiedener Herzinsuffizienzstadien mit zugrunde liegender IHD oder DCM führen.

Die Neuheit der Idee und unser Plan, die neuesten Genexpressions-Profiling-Techniken und die aktuellsten Bioinformatik-Methoden zu verwenden, könnten den Weg für die Veröffentlichung der Ergebnisse dieser Arbeit in High Impact Factor-Journalen sowohl im Bereich der Molekulargenetik als auch im Bereich der Kardiologie ebnen.

Das erwartete Ergebnis dieses Projekts kann eine Referenz für viele Master- und Doktoranden auf dem Gebiet der Herzinsuffizienz und der kardialen Molekulargenetik in Ägypten und auf der ganzen Welt sein. Angesichts der Tatsache, dass es unseres Wissens nach keine früheren Studien gibt, die die spezifische Genexpressionsprofilierung in verschiedenen Stadien der Herzinsuffizienz untersucht haben, kann die Neuheit der Idee von spezialisierten Wissenschaftlern auf diesem Gebiet häufig zitiert werden.

Ein frühzeitiges Screening von Patienten mit asymptomatischer struktureller Herzerkrankung mit hohem Risiko für die Entwicklung fortschreitender Herzinsuffizienzstadien kann helfen, ihr Fortschreiten durch pharmakologische und nicht-pharmakologische Strategien zu verhindern. Dies kann dazu beitragen, eine enorme Menge staatlicher Gelder einzusparen, die für die Pflege und Behandlung dieser Patienten in schwer symptomatisch dekompensierten Stadien der Herzinsuffizienz ausgegeben werden.

Der Plan der Forscher ist es, die Informationen, die in diesem Projekt enthüllt werden, weiter zu nutzen, um die neuesten untersuchten Techniken der RNA-Aktivierung und -Repression anzuwenden, um mit Genüberexpression und Gendysregulation bei Patienten zu behandeln, die an progressiven Stadien der VS-Herzinsuffizienz leiden. Patienten in primären asymptomatischen Stadien der Herzinsuffizienz, um den Weg für die innovative neuartige Gentherapie zur Verhinderung des Fortschreitens von primären Stadien zu progressiven Stadien der Herzinsuffizienz und zur Genesung von Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium in die stabilen asymptomatischen Stadien des normalen Lebensstils zu ebnen Krankheit. Diese neuartige Therapie wird nicht nur dazu beitragen, das Elend einer so großen Zahl von Ägyptern zu lindern, die an dieser stark beeinträchtigenden Krankheit leiden, sondern es wird auch ein revolutionärer wissenschaftlicher Durchbruch auf dem Gebiet der Gentherapie auf der ganzen Welt sein. Wir sind voller Glauben, dass wir die Ägypter sind, die Wunder vollbringen können durch Geduld, Entschlossenheit, Kampf und Glauben an unseren Traum.

B.4. State-of-the-Art und Exzellenz:

Herzinsuffizienz (HF) betrifft schätzungsweise 6,5 Millionen erwachsene Amerikaner [1]. Obwohl die Überlebensraten zwischen 1979 und 2000 um 10 % gestiegen sind, liegt die aktuelle 5-Jahres-Sterblichkeitsrate immer noch bei etwa 50 % [1, 2]. Ein langjähriges Paradigma ist, dass sich die Herzinsuffizienz im Endstadium mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) trotz einer Vielzahl von Ätiologien und genetischen Beiträgen über einen „endgültigen gemeinsamen Weg“ entwickelt [3, 4]. Klinische Studienergebnisse und aktuelle Leitlinien für das Management von HFrEF bestätigen diesen Standpunkt und eine direkte Therapie, die hauptsächlich auf dem Grad der linksventrikulären Ejektionsfraktion und dem klinischen Schweregrad unter Verwendung der Klassifikation der New York Heart Association (NYHA) basiert [5].

Laut WHO-Berichten ist die ischämische Herzkrankheit (IHD) weltweit die häufigste Todesursache und in den Industrieländern die Hauptursache für Herzinsuffizienz [6-9]. Es wurde festgestellt, dass eine Herzinsuffizienz als Folge einer IHD unabhängig mit höheren Sterblichkeitsraten im Vergleich zu einer nicht-ischämischen Ätiologie assoziiert ist [10, 11]. Die zunehmende Inzidenz wurde der hohen Wirksamkeit der thrombolytischen und primären perkutanen Koronarintervention bei der Behandlung akuter Myokardinfarkte zugeschrieben, die zu einem verbesserten Überleben der Patienten führt, jedoch häufig zu einer erhöhten Morbidität aufgrund von Umbau des linken Ventrikels (LV) und chronischer linker Herzkammer führt Funktionsstörung. Der Begriff ischämische Kardiomyopathie (ICM) wurde als systolische LV-Dysfunktion mit einem oder mehreren der folgenden Punkte definiert: Vorgeschichte einer früheren myokardialen Revaskularisation oder eines Myokardinfarkts, mehr als 75 % Stenose im linken Hauptstamm oder der linken vorderen absteigenden Arterie oder zwei Gefäße oder mehr mit einer Stenose von mehr als 75 % [12].

Eine der häufigsten Ursachen für Herzinsuffizienz sind Kardiomyopathien. Die American Heart Association beschrieb Kardiomyopathien als eine heterogene Gruppe von Myokarderkrankungen, die überwiegend genetisch bedingt sind und mit mechanischer und/oder elektrischer Dysfunktion einhergehen [13]. DCM ist durch das Vorhandensein einer linksventrikulären oder biventrikulären Dilatation und einer systolischen Dysfunktion in Abwesenheit abnormaler Belastungsbedingungen gekennzeichnet. Es ist die zweithäufigste Ursache für Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion. DCM ist eine komplexe Erkrankung mit vielfältigen genetischen Varianten und Umweltfaktoren, die den Krankheitsbeginn und den Krankheitsverlauf bestimmen [14, 15].

IHD und Kardiomyopathien induzieren eine Veränderung der Myokardstruktur und können zu Veränderungen der Herzfunktion führen [16], einschließlich einer Verringerung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF). Die Identifizierung von Patienten im Stadium „vor der Herzinsuffizienz“ kann die Entwicklung einer Herzinsuffizienz durch die Umsetzung angepasster medizinischer und nicht-medizinischer Strategien verhindern. Dieser stille präklinische Zustand (Präherzinsuffizienz) wird als asymptomatische linksventrikuläre Dysfunktion (ALVD) bezeichnet und kann nur durch die transthorakale Echokardiographie diskriminiert werden. Die ALVD, die in der Allgemeinbevölkerung verbreitet ist, führt zu einem hohen Risiko, eine manifeste Herzinsuffizienz zu entwickeln. In der Tat haben ALVD-Patienten eine 12-fach höhere jährliche Hospitalisierungsrate für Herzinsuffizienz beim ersten Ereignis im Vergleich zu Personen mit normaler LVEF [17] und ein 4-fach höheres Sterberisiko über einen Zeitraum von 6 Jahren [16]. . Ein effektives groß angelegtes Screening auf ALVD, das eine große unbewältigte klinische Herausforderung darstellt, erfordert eine Bestimmung von ALVD-Biomarkern.

Das Screening auf ALVD läuft seit über einem Jahrzehnt [17], [18]. Es gibt jedoch keine ALVD-Biomarker. Tatsächlich rechtfertigt die ALVD-Diagnose eine komplizierte echokardiographische Analyse, die zeitaufwändig und kostspielig ist und nicht auf die große Population von Risikopersonen anwendbar ist. Das Fehlen von Biomarkern kann von großer Bedeutung sein, da ALVD aufgrund der allgemeinen Zunahme kardiovaskulärer Risikofaktoren stark verbreitet ist [19]. ALVD hat sich als prädiktiver Frühindikator für eine schwere Herzinsuffizienz etabliert [20]. Follow-up-Studien haben gezeigt, dass Patienten mit ALVD eine durchschnittliche jährliche chronische Herzinsuffizienzrate von 4,9 bis 20 % aufweisen, bei einer Sterblichkeitsrate von 5,1 bis 10,5 % [21], [22]. Diese Beobachtungen wurden kürzlich in einer 5-Jahres-Überlebensratenanalyse bestätigt, die eine Sterblichkeitsrate von 31 % bei Patienten mit ALVD und von 47 % bei Patienten mit systolischer Herzinsuffizienz zeigte [23]. Schließlich zeigte die SOLVD-Studie, dass die Behandlung von ALVD das Auftreten von Herzinsuffizienz signifikant verzögern kann [24]. Daher kann es von größter klinischer Bedeutung sein, ALVD-Personen in der Allgemeinbevölkerung zu identifizieren, bevor sie eine manifeste Herzinsuffizienz entwickeln.

Es gibt nur wenige Studien, die spezifische genetische Biomarker für Patienten mit ischämischer Herzkrankheit (IHD) (mit oder ohne akuten Myokardinfarkt in der Vorgeschichte) oder DCM-Patienten mit normaler linksventrikulärer Funktion (Stadium B), IHD- oder DCM-Patienten untersucht haben mit typischer symptomatischer Herzinsuffizienz (Stadium C) und IHD- oder DCM-Patienten, die zu einer dekompensierten Herzinsuffizienz fortschreiten (Stadium D). Maciejak et al. [25] untersuchten die genetischen Biomarker von IHD-Patienten mit akutem Myokardinfarkt (AMI), die eine linksventrikuläre Dysfunktion VS entwickelten. Patienten mit akutem Myokardinfarkt, die zur gleichen Zeitdauer eine normale ventrikuläre Ejektionsfraktion beibehalten haben. Sie zeigten ein verändertes Genexpressionsprofil bei AMI, die HF entwickelten. Sweet et al. [26] analysierten das gesamte Transkriptom bei Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie (ICM) und DCM-Patienten im Vergleich zu gesunden Patienten ohne kardiovaskuläre Erkrankungen in der Vorgeschichte. Sie fanden wichtige ätiologiespezifische Signaturen, die für ICM und DCM typisch sind. Tijsen et al. [27] führten Mikro-RNA-Arrays bei gesunden Probanden, Patienten mit Herzinsuffizienz, Patienten mit Dyspnoe aufgrund von Herzinsuffizienz und Patienten mit Dyspnoe aus anderen Gründen als Herzinsuffizienz durch. Sie identifizierten 6 miRNAs, die bei Patienten mit Herzinsuffizienz erhöht sind, unter denen miR423-5p am stärksten mit der klinischen Diagnose von Herzinsuffizienz in Zusammenhang stand. Smih F. et al. [28] untersuchten durch Microarray-Analyse spezifische Genexpressionsprofile für asymptomatische linksventrikuläre Dysfunktion, nämlich Patienten vor Herzinsuffizienz. Keine der oben genannten Studien untersuchte die Genexpressionsprofile oder genetischen Biomarker-Signaturen, die spezifisch für progressive symptomatische Stadien der Herzinsuffizienz VS sind. präklinisches Stadium der Herzinsuffizienz.

Frühere Microarray-Studien zeigten unterschiedliche Genexpressionssignaturen zwischen Herzinsuffizienz-Ätiologien [28-33]; aber andere konnten keine Unterscheidungen finden [34, 35]. Die direkte RNA-Sequenzierung (RNA-seq) bietet auch eine genaue Quantifizierung von Transkripten und wurde verwendet, um Expressionssignaturen zwischen Herzinsuffizienz und nicht versagenden (NF) Herzen [36], neuartige Transkriptionsregulatoren und gestörte miRNA-Netzwerke in ICM oder DCM zu identifizieren [37 , 38], Prä- und Post-LVAD-Transkriptome [39, 40], häufige Herzinsuffizienz-Gene bei pädiatrischer Kardiomyopathie [41] und Splicing, eQTL und allelische Expression bei DCM [42].

Wir gehen davon aus, dass das vollständige Verständnis der spezifischen genetischen Variationen wie Genüberexpression oder Gendysregulation in solchen Kohorten von Patienten mit IHD oder DCM, die zu späteren Stadien der Herzinsuffizienz VS fortschreiten. IHD- oder DCM-Patienten, die eine normale systolische Funktion beibehalten, können den Weg ebnen, um diagnostische genetische Biomarker von IHD-Patienten und DCM-Patienten mit hohem Risiko für das Fortschreiten zu späteren Stadien der Herzinsuffizienz herauszufinden. Darüber hinaus kann die Ermittlung unterschiedlicher Genexpressionsprofile bei IHD- und DCM-Patienten in verschiedenen Stadien der Herzinsuffizienz der erste Schritt für die Innovation neuartiger Gentherapien zur Verhinderung des Fortschreitens der Herzinsuffizienz bei IHD-Patienten im Stadium B und zur Genesung von IHD-Patienten sein fortschreitende Stadien der Herzinsuffizienz (C und D).

B.7. Ansatz und Methodik:

1. Projektmanagement und Konsortium

2. Rekrutierung und Zuweisung von Patienten Das Protokoll dieser Studie wird vom institutionellen Prüfungsausschuss des kardiologischen Bildungskrankenhauses der Universität Asyut umfassend entworfen und überprüft. Alle Patienten werden aufgefordert, vor der Rekrutierung eine detaillierte Einverständniserklärung zu unterzeichnen.

   Einschlusskriterien: IHD- oder DCM-Patienten ohne Herzinsuffizienzsymptome (Stadium B), mit typischen Herzinsuffizienzsymptomen (Stadium C) und Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz (Stadium D).

   Ausschlusskriterien: Patienten mit anderen strukturellen Herzerkrankungen als IHD oder DCM.

   IHD-Patienten oder DCM-Patienten, die im kardiologischen Lehrkrankenhaus der Universität Assyut nachuntersucht werden, werden in diese Studie aufgenommen.

   Alle rekrutierten Patienten werden von mindestens zwei Kardiologen im Krankenhaus vollständigen Laboruntersuchungen und einer vollständigen körperlichen Untersuchung unterzogen. Alle Patienten werden einer echokardiographischen Untersuchung zur Erkennung und Bestätigung einer strukturellen Herzerkrankung und einer genauen Messung der Ejektionsfraktion für das Staging der Herzinsuffizienz unterzogen.

   Rekrutierte Patienten werden entsprechend dem aktuellen klinischen Stadium der Herzinsuffizienz einer der Studiengruppen zugeordnet.

   Gruppe A: IHD-Patienten ohne klinische Symptome einer Herzinsuffizienz und normaler linksventrikulärer systolischer Funktion (präklinisches Stadium oder Stadium B einer Herzinsuffizienz) Gruppe B: IHD-Patienten mit typischen klinischen Symptomen einer Herzinsuffizienz zusammen mit einer reduzierten Ejektionsfraktion < 35 % ( Herzinsuffizienz im Stadium C) Gruppe C: IHD-Patienten mit dekompensierter Herzinsuffizienz (Herzinsuffizienz im Stadium D) Gruppe D: DCM-Patienten ohne klinische Symptome einer Herzinsuffizienz und mit normaler linksventrikulärer systolischer Funktion (Herzinsuffizienz im präklinischen Stadium oder Stadium B) Gruppe E: DCM-Patienten mit typischen klinischen Symptomen einer Herzinsuffizienz zusammen mit reduzierter Ejektionsfraktion < 35 % (Herzinsuffizienz Stadium C) Gruppe F: Patienten mit DCM mit dekompensierter Herzinsuffizienz (Herzinsuffizienz Stadium D)

   Die Patienten werden aus den externen kardiologischen Kliniken, der internen kardiologischen Abteilung und der kardiologischen Intensivstation des kardiologischen Lehrkrankenhauses der Universität Assyut rekrutiert.

   Berechnung der Stichprobengröße Wir berechnen die Stichprobengröße von IHD-Patienten gemäß der Gleichung für die Stichprobengröße des deskriptiven Studiendesigns (43), basierend auf der Prävalenz der Gesamt-CHD-Prävalenz beträgt 6,7 % bei Erwachsenen ≥ 20 Jahren in den USA und der Prävalenz von DCM ist 5-8 pro 100000 (44).

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Stichprobenumfang Z1-α/2= Repräsentiert die Anzahl der Standardfehler vom Mittelwert (Konstante = 1,96) P = Repräsentiert den Anteil der besten Schätzung zum Wert des interessierenden Anteils. = Prävalenz D= die absolute Präzision, die auf beiden Seiten des Anteils oder der Entfernung erforderlich ist; wie nah an dem Interessenanteil die Schätzung liegen soll. 0,05.

   Die für IHD-Patienten erforderliche Stichprobengröße, basierend auf der Prävalenzrate von 0,067, beträgt 96 Patienten.

   Die für DCM-Patienten erforderliche Stichprobengröße, basierend auf der Prävalenzrate von 0,008, beträgt 11 Patienten. Die Gesamtstichprobengröße (einschließlich Kontrollpersonen) beträgt 107 Patienten.

3. Herzbiopsie

   Bioptome wird für die Entnahme von Ventrikelgewebe (Biopsie) verwendet. Die extrahierten Proben werden in flüssigem Stickstoff bei -80 Grad Celsius aufbewahrt.

4. Import von Kits, Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
5. RNA-Extraktion Gesamt-RNA wird aus Gewebeproben von Patienten mit verschiedenen klinischen Stadien der Herzinsuffizienz und gesunden Menschen unter Verwendung des Tempus TM -Spin-RNA-Isolierungskits in Tempus TM -Blut-RNA-Röhrchen extrahiert, das gemäß den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies Invitrogen, USA) empfohlen wird. (45) (Anhang A)

7- RNA-Sequenzierung

(Plattform Thermofisher Ion Torrent): Option A

Eine wirklich vollständige Transkriptomisolierung für die Sequenzierungsanalyse der nächsten Generation wird mit dem RiboMinus™ Eukaryote System v2 (Anhang C) hergestellt. Das Ion Total RNA-Seq Kit v2 wird für den einfachen Aufbau einer RNA-Bibliothek verwendet (Anhang D). Das Ion-Chef-System wird für die Walk-Away-Template-Vorbereitung und das Laden der Chips verwendet (Anhang E). Die Ion GeneStudio S5-Systeme werden für die Sequenzierung von Genpanels bis hin zum Transkriptom verwendet (Anhang F). Die Torrent Suite Software stellt die Sequenz-Reads automatisch in exportierbaren FASTQ- oder BAM-Formaten bereit (Anhang G).

8- Bioinformatik und Datenanalyse

Das „RNASeqAnalysis“-Plug-in der Torrent Suite-Software wird für die anfängliche Analyse einschließlich RNA-Transkript-Alignment und -Quantifizierung eingesetzt. Wir werden hg19 als menschliches Referenzgenom verwenden, wobei vollständige und partielle Alignments sowohl mit STAR- als auch mit Bowtie2-Mappern erkannt werden. Picard-Tools werden angewendet, um Reads zu zählen, die auf jedes Gen ausgerichtet sind, während Manschettenknöpfe-Software verwendet wird, um verschiedene Isoformen für jedes Gen darzustellen. Es werden umfassende Diagramme für einzelne Proben sowie Diagramme zum Vergleich von Proben erstellt . Die weitere spezifische Analyse wird mit intern entwickelten Skripten (in Python oder R) für die Berechnung der Faltungsänderung, die Identifizierung von hoch- und herunterregulierten Genen/Isoformen und die Pathway-Anreicherungsanalyse mit der Cytoscape-Software durchgeführt. Die Pathway-Enrichment-Analyse kann anhand von Zeitreihendaten Pathways identifizieren, die bei der Krankheit eine Rolle spielen könnten. Wir werden einen integrativen Multi-Omics-Ansatz anwenden, um Daten zu integrieren und zu korrelieren, die wir aus beiden Datentypen (RNA-Seq) erhalten haben.

9- Manuskriptverfassen und Veröffentlichung

Wir erwarten die Veröffentlichung dieser Projektergebnisse in mindestens zwei High-Impact-Factor-Journals auf dem Gebiet der Molekulargenetik und der Kardiologie.

B.8. Qualifikationen und Kompetenzen (max. 2 Seiten):

Die wichtigste Qualifikation ist die Verfügbarkeit professioneller Experten für Kardiologie und Molekulargenetik, die in der Lage sein werden, die Studie zügig durchzuführen. Außerdem sind in den Molekularlabors des nationalen Forschungszentrums, der Magdy Yaacoub-Stiftung und vielen anderen privaten Molekularlabors in Ägypten sehr teure, grundlegend wichtige Instrumente erhältlich, die sowohl für das Profiling der Genexpression von Microarrays als auch für die Sequenzierung von Ionen-Torrent-RNA-Sequenzen des gesamten Transkriptoms erforderlich sind.

Die wichtigsten Kompetenzen sind die hohen Kosten für Kits, Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und einige kleinere Instrumente, die für die vollständige Durchführung des Projekts angeschafft werden sollten.