缺血性心肌病的遗传学

B.3.结果和影响：

Magdy yacoub 爵士不止一次地修改了这个项目，我和所有项目团队都感到非常荣幸，他是 Magdy yaq 爵士。 被接受为该项目的共同研究者，这真实地反映了他的爱国主义和他对一切符合埃及人健康利益的关注在临床前发现代表缺血性心肌病患者和扩张型心肌病患者的遗传生物标志物和特征心力衰竭分期、心力衰竭症状临床分期和失代偿性终末期心力衰竭。 这些特定的生物标志物可以极大地用作 IHD 和 DCM 患者的诊断生物标志物，这些患者有极高的风险进展到心力衰竭的后期严重症状阶段。 通过密切监测以及治疗和非治疗策略，对这些患者进行早期筛查可能有助于防止他们进展到心力衰竭的后期阶段。 我们考虑到，用于减缓或预防典型症状性心力衰竭患者进展的传统药物——主要是 β 受体阻滞剂和血管紧张素转换酶抑制剂——已经被开给所有 IHD 患者，但没有证实能有效预防这些患者的进展患者为典型的心力衰竭患者（左心室功能不全患者）。 基于上述假设，非常需要新的疗法来阻止结构性心脏病患者（B 期心力衰竭）进展为典型和终末期心力衰竭患者（C 期和 D 期心力衰竭）。

预期结果可以解释无症状结构性心脏病（B 期心力衰竭）临床进展为典型症状性心力衰竭（C 期）和失代偿性心力衰竭（D 期）的新遗传途径。

该项目的预期结果可能会引导我们建立第一个埃及数据库，该数据库包含具有基础 IHD 或 DCM 的不同心力衰竭阶段的遗传生物标志物。

这个想法的新颖性和我们计划使用最新的基因表达谱分析技术和最新的生物信息学方法可能为在分子遗传学领域和心脏病学领域的高影响因子期刊上发表这项工作的结果铺平道路。

该项目的预期成果可为埃及乃至全球众多心力衰竭和心脏分子遗传学领域的硕士、博士研究生提供参考。 这个想法的新颖性，鉴于 - 就我们的大部分知识而言 - 之前没有研究调查心力衰竭不同阶段的特定基因表达谱，可能会吸引该领域专业科学家的高分引用。

早期筛查处于进行性心力衰竭阶段发展高风险的无症状结构性心脏病患者可能有助于通过药物和非药物策略预防其进展。 这可能有助于节省政府用于护理和治疗处于严重症状失代偿阶段的心力衰竭患者的大量资金。

研究人员的计划是进一步利用该项目中将揭示的信息，应用最新研究的 RNA 激活和抑制技术来治疗患有进行性心力衰竭 VS 患者的基因过表达和基因失调。那些处于心力衰竭初级无症状阶段的人为创新基因疗法铺平道路，以预防心力衰竭从初级阶段进展到进行性阶段，以及终末期心力衰竭患者恢复到稳定的无症状正常生活方式阶段疾病。 这种新颖的疗法不仅有助于减轻如此多的埃及人遭受这种严重致残疾病的痛苦，而且它将成为全世界基因治疗领域的科学革命性突破。 我们充满信心，我们是埃及人，可以通过耐心、决心、战斗和对梦想的信念来创造奇迹。

B.4.最先进和卓越：

据估计，心力衰竭 (HF) 影响着 650 万成年美国人 [1]。 尽管在 1979 年至 2000 年间生存率提高了 10%，但目前的 5 年死亡率仍约为 50% [1, 2]。 一个长期存在的范例是，射血分数降低的终末期心力衰竭 (HFrEF) 通过“最终共同途径”演变，尽管其病因和遗传因素多种多样 [3, 4]。 HFrEF 管理的临床试验结果和现行指南证实了这一观点，并且主要根据左心室射血分数的程度和使用纽约心脏协会 (NYHA) 分类的临床严重程度来指导治疗 [5]。

根据 WHO 报告，缺血性心脏病 (IHD) 是全球最常见的死亡原因，也是发达国家心力衰竭的主要原因 [6-9]。 与非缺血性病因相比，已发现继发于 IHD 的心力衰竭与更高的死亡率独立相关 [10, 11]。 发病率的增加归因于溶栓和直接经皮冠状动脉介入治疗在治疗急性心肌梗死方面的高效性，从而提高了患者的生存率，但由于左心室 (LV) 重塑和慢性左心室，通常会导致发病率增加功能障碍。 术语缺血性心肌病 (ICM) 被定义为 LV 收缩功能障碍，伴有以下一项或多项：既往有心肌血运重建或心肌梗死病史，左主干或左前降支狭窄超过 75%，或两个狭窄程度超过 75% 的血管或更多 [12]。

心力衰竭最常见的原因之一是心肌病。 美国心脏协会将心肌病描述为一组异质性心肌病，主要是遗传性的并且与机械和/或电功能障碍相关 [13]。 DCM 的特征是在没有异常负荷条件的情况下存在左心室或双心室扩张和收缩功能障碍。 它是导致射血分数降低的心力衰竭的第二大常见原因。 DCM 是一种复杂的疾病，具有决定疾病发作和病程的多种遗传变异和环境因素 [14, 15]。

IHD 和心肌病会引起心肌结构的改变，并可能导致心脏功能的改变 [16]，包括左心室射血分数 (LVEF) 的降低。 通过实施适应性医疗和非医疗策略，识别处于“心力衰竭前期”阶段的患者可能会预防 HF 的发展。 这种无症状的临床前状态（心力衰竭前）被称为无症状左心室功能障碍 (ALVD)，只能通过经胸超声心动图鉴别。 ALVD 在普通人群中很常见，导致显性心衰的高风险。 事实上，与 LVEF 正常的个体相比，ALVD 受试者的首次 HF 年住院率增加了 12 倍 [17]，并且在 6 年期间死亡风险增加了 4 倍 [16] . 对 ALVD 进行有效的大规模筛查是一项尚未解决的重大临床挑战，需要确定 ALVD 生物标志物。

ALVD 的筛查已经开始了十多年 [17]、[18]。 然而，没有 ALVD 生物标志物。 事实上，ALVD 诊断需要进行复杂的超声心动图分析，这既费时又昂贵，而且不适用于大量处于危险中的个体。 缺乏生物标志物可能非常重要，因为 ALVD 由于心血管危险因素的普遍增加而非常普遍 [19]。 ALVD 已被确定为严重 HF 的预测性早期指标 [20]。 后续研究表明，ALVD 患者的平均年慢性心力衰竭发生率为 4.9% 至 20%，死亡率为 5.1% 至 10.5% [21]，[22]。 这些观察最近在 5 年生存率分析中得到证实，该分析表明患有 ALVD 的受试者的死亡率为 31%，而患有收缩性 HF 的患者的死亡率为 47% [23]。 最后，SOLVD研究表明ALVD的治疗可以显着延缓HF的发生[24]。 因此，在一般人群发展为明显的 HF 之前识别 ALVD 个体可能具有最重要的临床意义。

很少有试验调查缺血性心脏病 (IHD) 患者（有或没有急性心肌梗死病史）或左心室功能正常的 DCM 患者（B 期）、IHD 或 DCM 患者的特异性遗传生物标志物具有典型症状的心力衰竭（C 期）和进展为失代偿性心力衰竭（D 期）的 IHD 或 DCM 患者。 Maciejak 等人，[25] 研究了发生左心室功能障碍 VS 的急性心肌梗死 (AMI) IHD 患者的遗传生物标志物。持续时间保持正常心室射血分数的急性心肌梗死患者。 他们证明了发生 HF 的 AMI 患者的基因表达谱发生了改变。 Sweet 等人，[26] 分析了缺血性心肌病 (ICM) 患者和 DCM 患者与没有心血管疾病病史的健康患者的全转录组。 他们发现了代表 ICM 和 DCM 的关键病因特异性特征。 Tijsen 等人，[27] 在健康受试者、心力衰竭患者、因心力衰竭导致呼吸困难的患者和因心力衰竭以外原因导致呼吸困难的患者中进行了微 RNA 阵列。 他们确定了 6 种在 HF 患者中升高的 miRNA，其中 miR423-5p 与 HF 的临床诊断密切相关。 Smih F 等人，[28] 通过微阵列分析研究了无症状左心室功能障碍（即心力衰竭前期患者）的特定基因表达谱。 上述试验均未研究心力衰竭 VS 进行性症状阶段特有的基因表达谱或遗传生物标志物特征。临床前心力衰竭阶段。

先前的微阵列研究揭示了 HF 病因之间的不同基因表达特征 [28-33]；但其他人未能找到区别 [34、35]。 直接 RNA 测序 (RNA-seq) 还提供准确的转录本定量，并已用于识别 HF 和非衰竭 (NF) 心脏之间的表达特征 [36]、ICM 或 DCM 中的新型转录调节因子和扰动的 miRNA 网络 [37 , 38]、LVAD 前后转录组 [39、40]、小儿心肌病中的常见 HF 基因 [41]，以及 DCM 中的剪接、eQTL 和等位基因表达 [42]。

我们假设，在进展到心力衰竭后期阶段的 IHD 或 DCM 患者队列中，充分了解特定的遗传变异，例如基因过度表达或基因失调。 保留正常收缩功能的 IHD 或 DCM 患者可能为发现 IHD 患者和 DCM 患者的诊断遗传生物标志物铺平道路，这些患者有进展到心力衰竭晚期的高风险。 此外，找出 IHD 和 DCM 受试者在心力衰竭不同阶段的差异基因表达谱可能是创新基因疗法创新的第一步，用于预防 B 期 IHD 患者的心力衰竭进展和 IHD 患者的康复心力衰竭的进展阶段（C 和 D）。

B.7.方法和方法论：

1. 项目管理和联合体

2. 患者招募和分配 本研究的方案将由 Asyut 大学教育心脏病医院的机构审查委员会广泛设计和审查。 招募前将要求所有患者签署详细的知情同意书。

   纳入标准：没有 HF 症状（B 期）、具有典型 HF 症状（C 期）和失代偿性 HF 患者（D 期）的 IHD 或 DCM 患者。

   排除标准：IHD 或 DCM 以外的结构性心脏病患者。

   本研究将招募在 Assyut 大学教育心脏病学医院随访的 IHD 患者或 DCM 患者。

   所有招募的患者都将接受医院至少两名心脏病专家的全面实验室检查和完整的身体检查。 所有患者都将进行超声心动图检查以检测和确认结构性心脏病，并准确测量射血分数以进行心力衰竭分期。

   招募的患者将根据心力衰竭的当前临床分期分配到其中一个研究组。

   A组：无心力衰竭临床症状且左心室收缩功能正常的IHD患者（临床前阶段或B期心力衰竭） B组：具有典型心力衰竭临床症状伴射血分数降低<35%的IHD患者（ C 期心力衰竭） C 组：失代偿性心力衰竭（D 期心力衰竭）的 IHD 患者 D 组：无心力衰竭临床症状且左心室收缩功能正常的 DCM 患者（临床前阶段或 B 期心力衰竭）组E：DCM伴典型心力衰竭临床症状伴射血分数降低<35%（C期心力衰竭） F组：DCM失代偿性心力衰竭患者（D期心力衰竭）

   患者将从 Assyut 大学教学心脏病医院的外部心脏病科诊所、内部心脏病科和重症监护病房招募。

   样本量计算 我们根据描述性研究设计（43）的样本量方程式计算 IHD 患者的样本量，基于总 CHD 患病率在 ≥ 20 岁的美国成年人中为 6.7% 和 DCM 患病率每 100000 人有 5-8 人 (44)。

   N = (Z1-α/2)2 P (1 - P)/ D2 N= Sample Size Z1-α/2= 表示与平均值的标准误差数（常数 = 1.96） P= 代表最佳猜测值的比例。 = 患病率 D= 比例或距离两边所需的绝对精度；估计值与利息比例的接近程度。 0.05。

   基于 0.067 的患病率，IHD 患者所需的样本量将为 96 名患者。

   基于 0.008 的患病率，DCM 患者所需的样本量为 11 名患者。总样本量（包括对照受试者）为 107 名患者。

3. 心脏活检

   活检钳将用于心室组织提取（活检）。 提取的标本将保存在- 80摄氏度的液氮中。

4. 试剂盒、化学品和消耗品进口
5. RNA提取总RNA将从不同临床心力衰竭阶段的患者和健康人的组织标本中提取，在制造商的说明书（Life Technologies Invitrogen，美国）推荐的Tempus TM Blood RNA Tube中使用Tempus TM spin RNA Isolation Kit。 (45)（附录 A）

7- RNA测序

（Thermofisher Ion Torrent 平台）：选项 A

将使用 RiboMinus™ Eukaryote System v2（附录 C）产生用于下一代测序分析的真正完整的转录组分离。 Ion Total RNA-Seq Kit v2 将用于简单的 RNA 文库构建（附录 D）。 Ion Chef 系统将用于无人值守模板制备和芯片加载（附录 E）。 Ion GeneStudio S5 系统将用于基因面板的测序，一直到转录组（附录 F）。 Torrent Suite 软件自动提供可导出的 FASTQ 或 BAM 格式的序列读数（附录 G）。

8- 生物信息学和数据分析

Torrent Suite 软件“RNASeqAnalysis”插件将用于初始分析，包括 RNA 转录物比对和量化。 我们将使用 hg19 作为人类参考基因组，其中将使用 STAR 和 Bowtie2 映射器检测完全和部分比对。 Picard 工具将用于计算与每个基因对齐的读数，而 cufflinks 软件将用于表示每个基因的不同异构体。 将为单个样本生成综合图，以及比较样本的图。 进一步的具体分析将使用内部开发的脚本（在 python 或 R 中）进行倍数变化计算、识别上调和下调的基因/亚型以及使用 Cytoscape 软件的通路富集分析。 通路富集分析可以识别可能在时间序列数据上对疾病起作用的通路。 我们将应用综合多组学方法来整合和关联我们从两种类型的数据 (RNA-Seq) 中获得的数据。

9- 稿件撰写与出版

我们预计该项目的发表至少会在分子遗传学领域和心脏病学领域的两个高影响因子期刊上发表。

B.8.资格和能力（最多 2 页）：

最重要的资格是能够迅速开展研究的专业心脏病学和分子遗传学专家的可用性。 此外，国家研究中心、Magdy Yaacoub 基金会和埃及许多其他私人分子实验室的分子实验室都提供微阵列基因表达谱分析和全转录组 ion torrent RNA 测序所需的非常昂贵的基本关键仪器。

最重要的能力是为完成项目而应购买的套件、化学品、消耗品和一些小型仪器的高成本。