Extracellulaire blaasjes als beroerte biomarkers (EXO4STROKE)

DOELSTELLING: Het doel van het project is de evaluatie van de prognostische kracht van circulerende extracellulaire blaasjes (EV's) in het serum van patiënten met een beroerte. De karakterisering door SPRi van verschillende families van EV's zal het mogelijk maken om de activeringsstatus van de processen van neuro-inflammatie, neuronale regeneratie, angiogenese en cellulaire schade te evalueren om een ​​beeld te krijgen van de reactiemechanismen op de schade die bij de patiënt plaatsvindt. Deze gegevens zullen worden gecorreleerd met opkomende prognostische markers afgeleid uit de literatuur (Gandolfi et al, 2017) en met de uitkomst van de revalidatie geëvalueerd met specifieke functionele en neurologische schalen die een nauwkeurige profilering van de patiënt en de evaluatie van functioneel herstel mogelijk maken, volgens wat onlangs is gevalideerd in het "Minimum revalidatie-evaluatieprotocol van de persoon met cerebrale beroerte versie 2020 - PMIC 2020" door de Italian Society of Physical and Rehabilitative Medicine (SIMFER) (https://springerhealthcare.it/mr/numero/volume-34 -N- 2 juni 2020 /).

De PMIC 2020 heeft als doel om elke fysiotherapeut / revalidatieteam een ​​uniform instrument te bieden voor de beoordeling van de persoon met een beroerte in de verschillende fasen van de ziekte, van acuut ziekenhuis tot territoriale revalidatie.

Specifieke doelstellingen zullen zijn:

i) optimalisatie van de SPRi-methode voor de identificatie van verschillende families van EV's in het serum van gezonde proefpersonen; ii) evaluatie van de haalbaarheid van de op SPRi gebaseerde methode voor de karakterisering van EV's uit het serum van patiënten met een beroerte; iii) voorstudie van de correlatie tussen SPRi-gegevens, oplosbare markers van ontsteking en regeneratie, patiëntprofilering en revalidatie-uitkomst bij ontslag.

IMPACT: De personalisering van het revalidatieplan in relatie tot het opgelopen letsel en de actieve respons van de patiënt zou leiden tot een grotere kans op functioneel herstel, met voordelen op het gebied van levenskwaliteit voor de patiënt en familieleden, en een vermindering van de behandeling kosten van de voor de National Health System.

MONSTERVERZAMELING: 80 patiënten na een beroerte zullen worden gevraagd om drie monsters van biologisch materiaal te ondergaan (10 ml bloed, twee buizen van 5 ml geschikt voor serumisolatie): de eerste afname op de tweede dag van de ziekenhuisopname (t0) bij IRCCS S. Maria Nascente (Mialno) of IRCCS Don Gnocchi (Florence) van Fondazioen Don Gnocchi; een tweede ontwenning bij ontslag (t1), of ongeveer 2 maanden na de eerste ontwenning. Waar mogelijk zal een derde bemonstering (t2 - follow-up) 6 maanden na het evenement worden uitgevoerd in het IRCCS S. Maria Nascente of in het IRCCS in Florence. 20 gezonde proefpersonen zullen worden gevraagd om een ​​enkel monster van biologisch materiaal te ondergaan (10 ml bloed, twee buizen van 5 ml die geschikt zijn voor serumisolatie).

EV-ISOLATIE: Het bloedmonster wordt verwerkt voor serumscheiding. De monsters worden gecodeerd, steriel verdeeld en tot gebruik bewaard bij -80°C in het Laboratorium voor Nanogeneeskunde en Klinische Biofotonica van IRCCS S. Maria Nascente (Milaan).

EV's zullen uit serum worden geïsoleerd door grootte-uitsluitingschromatografie (qEV; Izon). De daadwerkelijke isolatie zal worden geverifieerd met standaardtechnieken, waaronder bijvoorbeeld western blot voor specifieke eiwitmarkers (CD63, Flotillin 1), Nanoparticle Tracking Analysis of Transmission Electron Microscopy.

SPRi BIOSENSOR: De functionaliteit van de SPRi-chip zal worden geoptimaliseerd voor bekende markers van apoptotische lichamen (Annexin V; index van omvang van hersenbeschadiging) en van EV's van neuronen (Ephrin), microglia (IB4 of CD11b), astrocyten (GLAST) en endotheelcellen (CD31). De chip zal ook worden gefunctionaliseerd voor de herkenning van het Klotho-eiwit (Sahu et al, 2018).

Geïmmobiliseerde EV's zullen ook worden getest op de aanwezigheid op het oppervlak van receptoren die verband houden met neuronale regeneratie (TGFbR1/2), microgliale activering (TSPO) en angiogenese (VEGFR-2).

RAMAN-ANALYSE: EV's geïsoleerd uit patiëntenserum zullen ook worden geanalyseerd door Raman-spectroscopie volgens een protocol dat al is geoptimaliseerd voor patiënten met de ziekte van Parkinson (Gualerzi et al., 2019). Raman-analyse zal informatie opleveren over de biochemische eigenschappen van de EV's, die kunnen worden gecorreleerd met de moleculaire gegevens verkregen in SPRi.

ELISA: bekende markers van ontsteking en neuronale activering zullen in serum worden gekwantificeerd door middel van ELISA-assays: inflammatoire cytokines (IL6 en TNFa), adipokines (leptine), oplosbare adhesiemoleculen (sICAM, sFAS) en groeifactoren (BDNF).

Correlatie tussen SPRi-gegevens, oplosbare inflammatoire en neurotrofe factoren zal worden uitgevoerd om nieuwe revalidatiemarkers voor patiënten met een beroerte te identificeren