Pęcherzyki pozakomórkowe jako biomarkery udaru (EXO4STROKE)

CEL: Celem projektu będzie ocena mocy prognostycznej krążących pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w surowicy pacjentów po udarze mózgu. Charakterystyka SPRi różnych rodzin EV pozwoli na ocenę stanu aktywacji procesów zapalenia nerwów, regeneracji neuronów, angiogenezy i uszkodzeń komórkowych, dając obraz mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia zachodzące u pacjenta. Dane te zostaną skorelowane z pojawiającymi się markerami prognostycznymi pochodzącymi z literatury (Gandolfi i in., 2017) oraz z wynikiem rehabilitacji ocenianej za pomocą określonych skal funkcjonalnych i neurologicznych, które pozwalają na dokładne profilowanie pacjenta i ocenę powrotu do sprawności, zgodnie z co ostatnio zostało potwierdzone w „Protokole minimalnej oceny rehabilitacji osoby z udarem mózgu w wersji 2020 – PMIC 2020” przez Włoskie Towarzystwo Medycyny Fizycznej i Rehabilitacyjnej (SIMFER) (https://springerhealthcare.it/mr/numero/volume-34 -N- 2-czerwca-2020 /).

PMIC 2020 ma na celu zapewnienie każdemu fizjoterapeucie / Zespołowi Rehabilitacyjnemu jednolitego narzędzia do oceny osoby z udarem mózgu w różnych fazach choroby, od ostrej hospitalizacji po rehabilitację terytorialną.

Celami szczegółowymi będą:

i) optymalizacja metody SPRi do identyfikacji różnych rodzin EV w surowicy osób zdrowych; ii) ocena wykonalności metody opartej na SPRi do charakteryzowania EV z surowicy pacjentów po udarze; iii) wstępne badanie korelacji między danymi SPRi, rozpuszczalnymi markerami zapalenia i regeneracji, profilowaniem pacjentów i wynikami rehabilitacji przy wypisie.

WPŁYW: Personalizacja planu rehabilitacji w odniesieniu do odniesionego urazu i aktywnej reakcji pacjenta doprowadziłaby do zwiększenia prawdopodobieństwa odzyskania sprawności, z korzyścią w zakresie jakości życia pacjenta i członków jego rodziny oraz zmniejszenia kosztów leczenia kosztów dla Narodowego Systemu Zdrowia.

POBIERANIE PRÓBEK: 80 pacjentów po udarze zostanie poproszonych o pobranie trzech próbek materiału biologicznego (10 ml krwi, dwie probówki 5 ml odpowiednie do izolacji surowicy): pierwszy pobór w drugim dniu hospitalizacji (t0) w IRCCS S. Maria Nascente (Mialno) lub IRCCS Don Gnocchi (Florencja) z Fondazioen Don Gnocchi; drugie wycofanie przy wypisie (t1) lub około 2 miesiące po pierwszym wycofaniu. Tam, gdzie to możliwe, trzecie pobieranie próbek (t2 – kontrola) zostanie przeprowadzone 6 miesięcy po zdarzeniu w IRCCS S. Maria Nascente lub w IRCCS we Florencji. 20 zdrowych osób zostanie poproszonych o pobranie pojedynczej próbki materiału biologicznego (10 ml krwi, dwie probówki 5 ml odpowiednie do izolacji surowicy).

IZOLACJA EV: Próbka krwi zostanie przetworzona w celu oddzielenia surowicy. Próbki zostaną zakodowane, sterylnie podzielone na porcje i przechowywane w temperaturze -80°C w Laboratorium Nanomedycyny i Biofotoniki Klinicznej IRCCS S. Maria Nascente (Mediolan) do czasu użycia.

EV zostaną wyizolowane z surowicy za pomocą chromatografii wykluczania (qEV; Izon). Rzeczywista izolacja zostanie zweryfikowana standardowymi technikami, w tym na przykład western blot dla określonych markerów białkowych (CD63, Flotillin 1), analiza śledzenia nanocząstek lub transmisyjna mikroskopia elektronowa.

SPRi BIOSENSOR: Funkcjonalizacja chipa SPRi zostanie zoptymalizowana pod kątem znanych markerów ciałek apoptotycznych (aneksyna V; wskaźnik stopnia uszkodzenia mózgu) i EV z neuronów (efryna), mikrogleju (IB4 lub CD11b), astrocytów (GLAST) i komórki śródbłonka (CD31). Chip zostanie również sfunkcjonalizowany pod kątem rozpoznawania białka Klotho (Sahu i in., 2018).

Unieruchomione EV będą badane również pod kątem obecności na powierzchni receptorów związanych z regeneracją neuronów (TGFbR1/2), aktywacją mikrogleju (TSPO) i angiogenezą (VEGFR-2).

ANALIZA RAMANA: EV wyizolowane z surowicy pacjenta będą również analizowane za pomocą spektroskopii ramanowskiej zgodnie z protokołem już zoptymalizowanym dla pacjentów z chorobą Parkinsona (Gualerzi i in., 2019). Analiza ramanowska dostarczy informacji na temat właściwości biochemicznych EV, które można skorelować z danymi molekularnymi uzyskanymi w SPRi.

ELISA: znane markery stanu zapalnego i aktywacji neuronów zostaną oznaczone ilościowo w surowicy za pomocą testów ELISA: cytokiny zapalne (IL6 i TNFa), adipokiny (leptyna), rozpuszczalne cząsteczki adhezyjne (sICAM, sFAS) i czynniki wzrostu (BDNF).

Korelacja między danymi SPRi, rozpuszczalnymi czynnikami zapalnymi i neurotroficznymi zostanie przeprowadzona w celu zidentyfikowania nowych markerów rehabilitacji dla pacjentów po udarze mózgu