Vesículas Extracelulares como Biomarcadores de AVC (EXO4STROKE)

OBJETIVO: O objetivo do projeto será a avaliação do poder prognóstico das vesículas extracelulares (EVs) circulantes no soro de pacientes com AVC. A caracterização por SPRi de diferentes famílias de EVs permitirá avaliar o estado de ativação dos processos de neuroinflamação, regeneração neuronal, angiogênese e dano celular para fornecer uma imagem dos mecanismos de resposta ao dano ocorrido no paciente. Esses dados serão correlacionados com marcadores prognósticos emergentes derivados da literatura (Gandolfi et al, 2017) e com o resultado da reabilitação avaliado com escalas funcionais e neurológicas específicas que permitem o perfil preciso do paciente e a avaliação da recuperação funcional, de acordo com o que foi recentemente validado no "Protocolo mínimo de avaliação de reabilitação da pessoa com AVC Cerebral Versão 2020 - PMIC 2020" da Sociedade Italiana de Medicina Física e de Reabilitação (SIMFER) (https://springerhealthcare.it/mr/numero/volume-34 -n- 2-Junho-2020/).

O PMIC 2020 visa dotar cada Fisiatra/Equipa de Reabilitação de uma ferramenta uniforme para a avaliação da pessoa com AVC nas diferentes fases da doença, desde o hospital agudo até à reabilitação territorial.

Os objetivos específicos serão:

i) otimização do método SPRi para identificação de diferentes famílias de EVs no soro de indivíduos saudáveis; ii) avaliação da viabilidade do método baseado em SPRi para a caracterização de EVs a partir do soro de pacientes com AVC; iii) estudo preliminar da correlação entre dados SPRi, marcadores solúveis de inflamação e regeneração, perfil do paciente e resultado da reabilitação na alta.

IMPACTO: A personalização do plano de reabilitação face à lesão sofrida e à resposta ativa do doente conduziria a um aumento da probabilidade de recuperação funcional, com benefícios ao nível da qualidade de vida do doente e familiares, e redução da gestão custos do Sistema Nacional de Saúde.

COLETA DE AMOSTRAS: 80 pacientes pós-AVC serão submetidos a três amostras de material biológico (10 ml de sangue, dois tubos de 5 ml adequados para isolamento de soro): a primeira coleta no segundo dia de internação (t0) no IRCCS S. Maria Nascente (Mialno) ou IRCCS Don Gnocchi (Florença) da Fondazioen Don Gnocchi; uma segunda retirada na alta (t1), ou aproximadamente 2 meses após a primeira retirada. Sempre que possível, uma terceira amostragem (t2 - acompanhamento) será realizada 6 meses após o evento no IRCCS S. Maria Nascente ou no IRCCS em Florença. 20 indivíduos saudáveis ​​serão submetidos a uma única amostra de material biológico (10 ml de sangue, dois tubos de 5 ml adequados para isolamento de soro).

ISOLAMENTO EV: A amostra de sangue será processada para separação do soro. As amostras serão codificadas, aliquotadas estéreis e armazenadas a -80°C no Laboratório de Nanomedicina e Biofotônica Clínica do IRCCS S. Maria Nascente (Milão) até serem utilizadas.

As EVs serão isoladas do soro por cromatografia de exclusão de tamanho (qEV; Izon). O isolamento real será verificado com técnicas padrão, incluindo, por exemplo, western blot para marcadores de proteínas específicas (CD63, Flotillin 1), análise de rastreamento de nanopartículas ou microscopia eletrônica de transmissão.

SPRi BIOSENSOR: A funcionalização do chip SPRi será otimizada para marcadores conhecidos de corpos apoptóticos (Anexina V; índice de extensão de dano cerebral) e de EVs de neurônios (Ephrin), microglia (IB4 ou CD11b), astrócitos (GLAST) e células endoteliais (CD31). O chip também será funcionalizado para o reconhecimento da proteína Klotho (Sahu et al, 2018).

Os EVs imobilizados serão testados também quanto à presença na superfície de receptores relacionados à regeneração neuronal (TGFbR1/2), ativação microglial (TSPO) e angiogênese (VEGFR-2).

ANÁLISE RAMAN: EVs isolados do soro do paciente também serão analisados ​​por espectroscopia Raman de acordo com um protocolo já otimizado para pacientes com doença de Parkinson (Gualerzi et al., 2019). A análise Raman fornecerá informações sobre as características bioquímicas dos EVs, que podem ser correlacionadas com os dados moleculares obtidos no SPRi.

ELISA: marcadores conhecidos de inflamação e ativação neuronal serão quantificados no soro por ensaios de ELISA: citocinas inflamatórias (IL6 e TNFa), adipocinas (leptina), moléculas de adesão solúveis (sICAM, sFAS) e fatores de crescimento (BDNF).

Correlação entre dados de SPRi, fatores inflamatórios solúveis e neurotróficos será realizada para identificar novos marcadores de reabilitação para pacientes com AVC