Vesículas extracelulares como biomarcadores de accidentes cerebrovasculares (EXO4STROKE)

OBJETIVO: El objetivo del proyecto será la evaluación del poder pronóstico de las vesículas extracelulares (VE) circulantes en el suero de pacientes con ictus. La caracterización por SPRi de diferentes familias de EVs permitirá evaluar el estado de activación de los procesos de neuroinflamación, regeneración neuronal, angiogénesis y daño celular para dar una idea de los mecanismos de respuesta al daño que se producen en el paciente. Estos datos se correlacionarán con marcadores pronósticos emergentes derivados de la literatura (Gandolfi et al, 2017) y con el resultado de la rehabilitación evaluado con escalas funcionales y neurológicas específicas que permitan perfilar con precisión al paciente y evaluar la recuperación funcional, según lo validado recientemente en el "Protocolo de evaluación de la rehabilitación mínima de la persona con ictus cerebral Versión 2020 - PMIC 2020" de la Sociedad Italiana de Medicina Física y Rehabilitación (SIMFER) (https://springerhealthcare.it/mr/numero/volume-34 -norte- 2-junio-2020/).

El PMIC 2020 tiene como objetivo dotar a cada fisiatra/Equipo de Rehabilitación de una herramienta uniforme para la valoración de la persona con ictus en las diferentes fases de la enfermedad, desde el agudo hospitalario hasta la rehabilitación territorial.

Los objetivos específicos serán:

i) optimización del método SPRi para la identificación de diferentes familias de EVs en el suero de sujetos sanos; ii) evaluación de la viabilidad del método basado en SPRi para la caracterización de EV del suero de pacientes con accidente cerebrovascular; iii) estudio preliminar de la correlación entre los datos de SPRi, los marcadores solubles de inflamación y regeneración, el perfil del paciente y el resultado de la rehabilitación al alta.

IMPACTO: La personalización del plan de rehabilitación en relación con la lesión sufrida y la respuesta activa del paciente conduciría a una mayor probabilidad de recuperación funcional, con beneficios en términos de calidad de vida para el paciente y familiares, y una reducción en el manejo costes de la para el Sistema Nacional de Salud.

RECOGIDA DE MUESTRAS: Se pedirá a 80 pacientes después de un accidente cerebrovascular que se sometan a tres muestras de material biológico (10 ml de sangre, dos tubos de 5 ml adecuados para el aislamiento del suero): la primera recogida en el segundo día de hospitalización (t0) en el IRCCS S. Maria Nascente (Mialno) o IRCCS Don Gnocchi (Florencia) de Fondazioen Don Gnocchi; una segunda retirada al alta (t1), o aproximadamente 2 meses después de la primera retirada. Siempre que sea posible, se realizará un tercer muestreo (t2 - seguimiento) 6 meses después del evento en el IRCCS S. Maria Nascente o en el IRCCS de Florencia. Se pedirá a 20 sujetos sanos que se sometan a una sola muestra de material biológico (10 ml de sangre, dos tubos de 5 ml aptos para el aislamiento del suero).

AISLAMIENTO EV: La muestra de sangre se procesará para la separación del suero. Las muestras serán codificadas, alicuotadas estériles y almacenadas a -80°C en el Laboratorio de Nanomedicina y Biofotónica Clínica del IRCCS S. Maria Nascente (Milán) hasta su uso.

Los EV se aislarán del suero mediante cromatografía de exclusión por tamaño (qEV; Izon). El aislamiento real se verificará con técnicas estándar, que incluyen, por ejemplo, Western blot para marcadores de proteínas específicos (CD63, Flotillin 1), análisis de seguimiento de nanopartículas o microscopía electrónica de transmisión.

BIOSENSOR SPRi: La funcionalización del chip SPRi se optimizará para marcadores conocidos de cuerpos apoptóticos (Anexina V; índice de extensión del daño cerebral) y de EV de neuronas (Ephrin), microglía (IB4 o CD11b), astrocitos (GLAST) y células endoteliales (CD31). El chip también será funcionalizado para el reconocimiento de la proteína Klotho (Sahu et al, 2018).

Los vehículos eléctricos inmovilizados también se analizarán para detectar la presencia en la superficie de receptores relacionados con la regeneración neuronal (TGFbR1/2), la activación microglial (TSPO) y la angiogénesis (VEGFR-2).

ANÁLISIS RAMAN: los vehículos eléctricos aislados del suero del paciente también se analizarán mediante espectroscopia Raman de acuerdo con un protocolo ya optimizado para pacientes con enfermedad de Parkinson (Gualerzi et al., 2019). El análisis Raman proporcionará información sobre las características bioquímicas de los vehículos eléctricos, que se pueden correlacionar con los datos moleculares obtenidos en SPRi.

ELISA: mediante ensayos ELISA se cuantificarán en suero marcadores conocidos de inflamación y activación neuronal: citocinas inflamatorias (IL6 y TNFa), adipocinas (leptina), moléculas de adhesión solubles (sICAM, sFAS) y factores de crecimiento (BDNF).

Se realizará una correlación entre los datos de SPRi, los factores inflamatorios solubles y neurotróficos para identificar nuevos marcadores de rehabilitación para pacientes con accidente cerebrovascular.