Ekstracellulære vesikler som slagbiomarkører (EXO4STROKE)

MÅL: Målet med prosjektet vil være evaluering av den prognostiske kraften til sirkulerende ekstracellulære vesikler (EV) i serum hos slagpasienter. Karakteriseringen av SPRi av forskjellige familier av elbiler vil tillate å evaluere aktiveringsstatusen til prosessene med nevroinflammasjon, nevronal regenerering, angiogenese og cellulær skade for å gi et bilde av mekanismene for respons på skaden som finner sted hos pasienten. Disse dataene vil være korrelert med fremvoksende prognostiske markører hentet fra litteraturen (Gandolfi et al, 2017) og med resultatet av rehabiliteringen evaluert med spesifikke funksjonelle og nevrologiske skalaer som tillater nøyaktig profilering av pasienten og evaluering av funksjonell utvinning, iht. det som nylig ble validert i "Minimumsrehabiliteringsevalueringsprotokollen til personen med hjerneslag versjon 2020 - PMIC 2020" av den italienske foreningen for fysisk og rehabiliterende medisin (SIMFER) (https://springerhealthcare.it/mr/numero/volume-34 -n- 2. juni 2020 /).

PMIC 2020 har som mål å gi hver fysiater/rehabiliteringsteam et enhetlig verktøy for vurdering av personen med hjerneslag i de ulike fasene av sykdommen, fra akuttsykehus til territoriell rehabilitering.

Spesifikke mål vil være:

i) optimalisering av SPRi-metoden for identifisering av forskjellige familier av elbiler i serumet til friske personer; ii) evaluering av gjennomførbarheten av den SPRi-baserte metoden for karakterisering av elbiler fra serum fra slagpasienter; iii) foreløpig studie av korrelasjonen mellom SPRi-data, løselige markører for betennelse og regenerering, pasientprofilering og rehabiliteringsresultat ved utskrivning.

KONSEKVENSER: Personaliseringen av rehabiliteringsplanen i forhold til den påførte skaden og pasientens aktive respons vil føre til økt sannsynlighet for funksjonell bedring, med fordeler i form av livskvalitet for pasienten og familiemedlemmer, og en reduksjon i håndteringen kostnader for det nasjonale helsevesenet.

PRØVEINNSAMLING: 80 pasienter etter hjerneslag vil bli bedt om å gjennomgå tre prøver av biologisk materiale (10 ml blod, to 5 ml rør egnet for serumisolering): den første innsamlingen på den andre sykehusinnleggelsesdagen (t0) ved IRCCS S. Maria Nascente (Mialno) eller IRCCS Don Gnocchi (Firenze) fra Fondazioen Don Gnocchi; et andre uttak ved utskrivning (t1), eller ca. 2 måneder etter det første uttaket. Der det er mulig, vil en tredje prøvetaking (t2 - oppfølging) bli utført 6 måneder etter arrangementet ved IRCCS S. Maria Nascente eller ved IRCCS i Firenze. 20 friske forsøkspersoner vil bli bedt om å gjennomgå en enkelt prøve av biologisk materiale (10 ml blod, to 5 ml rør egnet for serumisolering).

EV ISOLASJON: Blodprøven vil bli behandlet for serumseparasjon. Prøvene vil bli kodet, sterilt alikvotert og lagret ved -80°C ved Laboratory of Nanomedicine and Clinical Biophotonics of IRCCS S. Maria Nascente (Milano) inntil de skal brukes.

EV-er vil bli isolert fra serum ved størrelseseksklusjonskromatografi (qEV; Izon). Selve isolasjonen vil bli verifisert med standardteknikker, inkludert for eksempel western blot for spesifikke proteinmarkører (CD63, Flotillin 1), nanopartikkelsporingsanalyse eller transmisjonselektronmikroskopi.

SPRI BIOSENSOR: Funksjonaliseringen av SPRi-brikken vil bli optimalisert for kjente markører for apoptotiske kropper (Annexin V; indeks for omfanget av hjerneskade) og av EV-er fra nevroner (Ephrin), mikroglia (IB4 eller CD11b), astrocytter (GLAST) og endotelceller (CD31). Brikken vil også bli funksjonalisert for gjenkjennelse av Klotho-proteinet (Sahu et al, 2018).

Immobiliserte elbiler vil også bli testet for tilstedeværelse på overflaten av reseptorer relatert til nevronal regenerering (TGFbR1 / 2), mikroglial aktivering (TSPO) og angiogenese (VEGFR-2).

RAMAN-ANALYSE: EV-er isolert fra pasientserum vil også bli analysert ved Raman-spektroskopi i henhold til en protokoll som allerede er optimalisert for pasienter med Parkinsons sykdom (Gualerzi et al., 2019). Raman-analyse vil gi informasjon om de biokjemiske egenskapene til elbilene, som kan korreleres med de molekylære dataene oppnådd i SPRi.

ELISA: kjente markører for inflammasjon og nevronal aktivering vil kvantifiseres i serum ved ELISA-analyser: inflammatoriske cytokiner (IL6 og TNFa), adipokiner (leptin), løselige adhesjonsmolekyler (sICAM, sFAS) og vekstfaktorer (BDNF).

Korrelasjon mellom SPRi-data, løselige inflammatoriske og nevrotrofiske faktorer vil bli utført for å identifisere nye rehabiliteringsmarkører for slagpasienter