Mitochondrialna funkcja komórek odpornościowych w sepsie (MitoSepsis)

Tło

Dowody sugerują, że posocznica i wstrząs septyczny poważnie upośledzają mitochondria i że wynikająca z tego dysfunkcja mitochondriów jest związana z ciężkością i wynikiem dysfunkcji narządu. W sepsie nieprawidłowości mitochondrialne - biochemiczne i ultrastrukturalne - zostały rozpoznane w wielu narządach, w tym w wątrobie, nerkach, tkance mięśnia szkieletowego i serca oraz komórkach krwi. Systematyczny przegląd funkcji mitochondriów oceniany na podstawie zużycia tlenu, oddychania w stanie 3 i 4, aktywności enzymów oddechowych lub poziomów ATP w tkankach i szybkości obrotu wykazał zmniejszoną funkcję, zwłaszcza w modelach sepsy trwających dłużej niż 16 godzin. Zmniejszony poziom zredukowanego glutationu, ważnego wewnątrzmitochondrialnego przeciwutleniacza, w połączeniu ze zwiększonym wytwarzaniem reaktywnych form tlenu (ROS) i reaktywnych form azotu (RNS) hamuje fosforylację oksydacyjną i wytwarzanie ATP. To nabyte wewnętrzne zaburzenie metabolizmu energii komórkowej przyczynia się do zmniejszenia aktywności kompleksów enzymatycznych mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów i upośledzonej biosyntezy ATP oraz przyczynia się do dysfunkcji narządu w sepsie.

Krążące komórki odpornościowe odgrywają ważną rolę w patofizjologii sepsy. Stymulacja układu odpornościowego zmienia wymagania energetyczne komórek odpornościowych; regulacja w dół aktywności komórek odpornościowych była związana z przedłużającą się posocznicą. Aktywacja komórek odpornościowych wymusza wzrost zapotrzebowania na energię, dlatego zmniejszona produkcja ATP z powodu upośledzonej funkcji mitochondriów może być czynnikiem modulującym odpowiedź immunologiczną w sepsie. Zmiany w funkcji mitochondriów i niewydolność energetyczna zostały zgłoszone w jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej i wydają się być związane z modulacją odpowiedzi immunologicznej na posocznicę. Makrofagi inkubowane z endotoksyną/interferonem-γ wykazują spadek zużycia tlenu i hamowanie mitochondrialnego kompleksu I. Zaproponowano różne mechanizmy zmiany funkcji mitochondriów w tych komórkach, w tym wzrost produkcji NO i nitracji białek mitochondrialnych [14], podwyższenie poziomu IL-10 [15] lub prostaglandyn. W ludzkich neutrofilach nienaruszona funkcja mitochondriów odgrywa ważną rolę w chemotaksji i fagocytozie, upośledzenie tych mechanizmów prowadzi do zmniejszonej zdolności obronnej przed wyzwaniami drobnoustrojów.

HIF-1α jest czynnikiem transkrypcyjnym, który działa jako kluczowy czynnik regulujący ewolucję homeostazy tlenowej. W warunkach normoksycznych HIF-1α jest w sposób ciągły syntetyzowany i rozkładany po hydroksylacji przez dioksygenazy, które jako substraty wykorzystują tlen, Fe i α-ketoglutaran. Podczas niedotlenienia niska dostępność tlenu ogranicza reakcję; HIF-1α nie ulega już degradacji i szybko się gromadzi i wyzwala transkrypcję genów zaangażowanych w homeostazę tlenową, takich jak enzymy glikolityczne, transportery glukozy, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i erytropoetyna. W warunkach niedotlenienia HIF pośredniczy również w obniżeniu poziomów mRNA białek łańcucha oddechowego, przygotowując komórkę do produkcji ATP głównie z glikolizy, a nie z fosforylacji oksydacyjnej, optymalizując w ten sposób energetykę komórki i homeostazę pod kątem przeżycia i funkcji podczas niedotlenienia.

Niedawno opublikowane doniesienia powiązały zapalenie i stymulację endotoksyn z aktywacją HIF-1α. Wykazano, że HIF-1α jest regulowany w górę i stabilizowany w makrofagach i monocytach traktowanych LPS w warunkach normoksycznych. Wykazano, że poziomy HIF-1α zmniejszają się w makrofagach z niedoborem TLR4 po stymulacji LPS, co sugeruje, że w stymulacji HIF-1α przez LPS pośredniczy TLR4.

Dane na temat funkcji mitochondriów ludzkich komórek odpornościowych w ciężkiej sepsie są ograniczone, a potencjalna korelacja między zapotrzebowaniem i produkcją energii mitochondriów a ciężkością stanu pacjenta i wynikami nie jest dobrze ustalona. Reakcja immunologiczna w przebiegu ciężkiej sepsy i wstrząsu septycznego składa się z współzależnego, wysoce złożonego systemu, w który zaangażowane są różne typy komórek odpornościowych oraz cytokiny pro- i przeciwzapalne zaangażowane w proces zależny od czasu. Proste badania in vitro oceniające funkcję mitochondriów pojedynczego typu komórek odpornościowych i pojedynczych cytokin tylko w jednym momencie w przebiegu procesu septycznego mogą nie być odpowiednim modelem odzwierciedlającym złożone interakcje układu odpornościowego. Szeregowe pomiary funkcji mitochondriów różnych kluczowych komórek oraz specyficznych cytokin pro- i przeciwzapalnych oraz markerów apoptozy równolegle z innymi klinicznymi i laboratoryjnymi markerami posocznicy mogą zapewnić bardziej dogłębną ocenę i zrozumienie tego szkodliwego wzorca choroby.

Cel

Celem projektu jest kompleksowe zbadanie zmian funkcji mitochondriów i morfologii komórek odpornościowych u pacjentów z ciężką sepsą i wstrząsem septycznym. Planujemy ocenić zmiany funkcji mitochondriów monocytów, limfocytów B i limfocytów T CD4+ w korelacji z poziomami różnych cytokin oraz klasycznymi klinicznymi i laboratoryjnymi parametrami ciężkości i przebiegu sepsy.

Metody

Łącznie 30 pacjentów przyjętych na oddział intensywnej terapii (OIOM) szpitala trzeciego stopnia z powodu ciężkiej sepsy lub wstrząsu septycznego zostanie włączonych do badania po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody pacjenta lub jego najbliższej rodziny. Wykluczeni są pacjenci z wszelkiego rodzaju przewlekłymi chorobami zakaźnymi, zapalnymi lub autoimmunologicznymi, po przeszczepach lub otrzymujący leki immunosupresyjne.

Grupa kontrolna: 30 zdrowych ochotników Ocena funkcji mitochondriów monocytów/granulocytów zostanie przeprowadzona przez pomiar aktywności kompleksu mitochondrialnego przy użyciu standardowego protokołu miareczkowania do pomiaru aktywacji kompleksu I do IV. Do pomiaru poziomów w surowicy IL-1, IL-6, IL-10 i TNF zostaną użyte standardowe zestawy handlowe.