Funzione mitocondriale delle cellule immunitarie nella sepsi (MitoSepsis)

Sfondo

Le prove suggeriscono che la sepsi e lo shock settico compromettono gravemente i mitocondri e che la conseguente disfunzione mitocondriale è correlata alla gravità e all'esito della conseguente disfunzione d'organo. Nella sepsi le anomalie mitocondriali - biochimiche e ultrastrutturali - sono state riconosciute in più organi, tra cui fegato, rene, tessuto muscolare scheletrico e cardiaco e cellule del sangue. Una revisione sistematica sulla funzione mitocondriale valutata come consumo di ossigeno, respirazione di stato 3 e stato 4, attività degli enzimi respiratori o livelli di ATP tissutale e tassi di turnover ha mostrato una funzione ridotta soprattutto nei modelli di sepsi che durano più di 16 ore . Livelli impoveriti di glutatione ridotto, un importante antiossidante intra-mitocondriale, in combinazione con una maggiore generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e specie reattive dell'azoto (RNS) inibiscono la fosforilazione ossidativa e la generazione di ATP. Questo squilibrio intrinseco acquisito nel metabolismo energetico cellulare contribuisce alla riduzione delle attività dei complessi enzimatici della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali e alla ridotta biosintesi dell'ATP e contribuisce alla disfunzione dell'organo nella sepsi.

Le cellule immunitarie circolanti svolgono un ruolo importante nella fisiopatologia della sepsi. La stimolazione del sistema immunitario altera il fabbisogno energetico delle cellule immunitarie; la sottoregolazione dell'attività delle cellule immunitarie è stata associata a sepsi prolungata. L'attivazione delle cellule immunitarie impone un aumento del fabbisogno energetico, quindi una ridotta produzione di ATP a causa della ridotta funzione mitocondriale può essere un fattore nella modulazione della risposta immunitaria nella sepsi. Alterazioni della funzione mitocondriale e insufficienza energetica sono state riportate nelle cellule mononucleate del sangue periferico e sembrano essere associate alla modulazione della risposta immunitaria alla sepsi. I macrofagi incubati con endotossina/interferone-γ mostrano una diminuzione del consumo di ossigeno e l'inibizione del complesso I mitocondriale. Sono stati proposti diversi meccanismi per l'alterazione della funzione mitocondriale in queste cellule, tra cui l'aumento della produzione di NO e la nitrazione delle proteine ​​mitocondriali [14], l'aumento dei livelli di IL-10 [15] o delle prostaglandine. Nei neutrofili umani la funzione mitocondriale intatta gioca un ruolo importante nella chemiotassi e nella fagocitosi, la compromissione di questi meccanismi porta a una ridotta capacità di difesa alle sfide microbiche.

HIF-1α è un fattore di trascrizione che funge da fattore regolatore chiave nell'evoluzione dell'omeostasi dell'ossigeno. In condizioni normossiche, l'HIF-1α viene continuamente sintetizzato e degradato dopo l'idrossilazione da parte di diossigenasi che utilizzano ossigeno, Fe e α-chetoglutarato come substrati. Durante l'ipossia, la scarsa disponibilità di ossigeno limita la reazione; L'HIF-1α non è più degradato e si accumula rapidamente e innesca la trascrizione dei geni coinvolti nell'omeostasi dell'ossigeno come gli enzimi glicolitici, i trasportatori del glucosio, il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e l'eritropoietina. In condizioni ipossiche, HIF media anche una diminuzione dei livelli di mRNA delle proteine ​​della catena respiratoria, preparando la cellula a produrre ATP principalmente dalla glicolisi e non dalla fosforilazione ossidativa, ottimizzando così l'energetica cellulare e l'omeostasi per la sopravvivenza e la funzione durante l'ipossia.

Recenti rapporti pubblicati hanno collegato l'infiammazione e la stimolazione dell'endotossina all'attivazione di HIF-1α. È stato dimostrato che HIF-1α è sovraregolato e stabilizzato nei macrofagi e nei monociti trattati con LPS in condizioni normossiche. È stato dimostrato che i livelli di HIF-1α sono diminuiti nei macrofagi carenti di TLR4 dopo la stimolazione LPS, suggerendo che la stimolazione LPS di HIF-1α è mediata da TLR4.

I dati sulla funzione mitocondriale delle cellule immunitarie umane nella sepsi grave sono limitati e la potenziale correlazione tra il fabbisogno e la produzione di energia mitocondriale e la gravità delle condizioni e dell'esito del paziente non sono ben stabilite. La reazione immunologica nel contesto della sepsi grave e dello shock settico consiste in un sistema interdipendente altamente complesso che coinvolge diversi tipi di cellule immunitarie e citochine pro e antinfiammatorie coinvolte in un processo dipendente dal tempo. Semplici studi in vitro che valutano la funzione mitocondriale di un singolo tipo di cellule immunitarie e singole citochine in un solo momento nel corso del processo settico potrebbero non essere un modello appropriato per rispecchiare le complesse interazioni del sistema immunitario. Misurazioni seriali della funzione mitocondriale di diverse cellule chiave e specifiche citochine pro e antinfiammatorie e marcatori di apoptosi parallelamente ad altri marcatori clinici e di laboratorio della sepsi possono offrire una valutazione e una comprensione più approfondite di questo modello di malattia deleteria.

Obbiettivo

Lo scopo del progetto è quello di studiare in modo completo i cambiamenti nella funzione mitocondriale e nella morfologia delle cellule immunitarie nei pazienti con sepsi grave e shock settico. Ci proponiamo di valutare i cambiamenti nella funzione mitocondriale di monociti, cellule B e cellule T CD4+ in correlazione ai livelli di varie citochine e ai classici parametri clinici e di laboratorio di gravità della sepsi e dell'esito.

Metodi

Un totale di 30 pazienti ricoverati nell'unità di terapia intensiva (ICU) di un ospedale di cure terziarie a causa di sepsi grave o shock settico saranno inclusi nello studio dopo aver ottenuto il consenso informato scritto del paziente o del parente più prossimo del paziente. Sono esclusi i pazienti con qualsiasi tipo di malattia cronica infettiva, infiammatoria o autoimmune, dopo trapianti o in trattamento con agenti immunosoppressori.

Controlli: 30 volontari sani La valutazione della funzione mitocondriale di monociti/granulociti sarà eseguita misurando l'attività del complesso mitocondriale utilizzando un protocollo di titolazione standard per misurare l'attivazione del complesso da I a IV. Per misurare i livelli sierici di IL-1, IL-6, IL-10 e TNF verranno utilizzati kit commerciali standard.