Mitochondriální funkce imunitních buněk při sepsi (MitoSepsis)

Pozadí

Důkazy naznačují, že sepse a septický šok vážně poškozují mitochondrie a že výsledná mitochondriální dysfunkce souvisí se závažností a výsledkem výsledné orgánové dysfunkce. Při sepsi byly mitochondriální abnormality - biochemické a ultrastrukturální - rozpoznány v mnoha orgánech, včetně jater, ledvin, tkáně kosterního a srdečního svalu a krevních buněk. Systematický přehled mitochondriálních funkcí hodnocených jako spotřeba kyslíku, respirace ve 3. a 4. stavu, aktivita respiračních enzymů nebo hladiny tkáňového ATP a rychlosti obratu ukázaly sníženou funkci, zejména u modelů sepse trvajících déle než 16 hodin. Vyčerpané hladiny redukovaného glutathionu, důležitého intramitochondriálního antioxidantu, v kombinaci se zvýšenou tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS) a reaktivních forem dusíku (RNS) inhibují oxidativní fosforylaci a tvorbu ATP. Tato získaná vnitřní porucha v buněčném energetickém metabolismu přispívá ke snížení aktivity enzymových komplexů mitochondriálního elektronového transportního řetězce a zhoršené biosyntéze ATP a přispívá k orgánové dysfunkci při sepsi.

Cirkulující imunitní buňky hrají důležitou roli v patofyziologii sepse. Stimulace imunitního systému mění energetické požadavky imunitních buněk; down-regulace aktivity imunitních buněk byla spojena s prodlouženou sepsí. Aktivace imunitních buněk vyžaduje zvýšení energetických požadavků, takže snížená produkce ATP v důsledku zhoršené mitochondriální funkce může být faktorem při modulaci imunitní odpovědi při sepsi. V mononukleárních buňkách periferní krve byly hlášeny změny mitochondriální funkce a energetické selhání a zdá se, že jsou spojeny s modulací imunitní odpovědi na sepsi. Makrofágy inkubované s endotoxinem/interferonem-y vykazují snížení spotřeby kyslíku a inhibici mitochondriálního I komplexu. Byly navrženy různé mechanismy pro změnu mitochondriální funkce v těchto buňkách, včetně zvýšení produkce NO a nitrace mitochondriálních proteinů [14], zvýšení hladin IL-10 [15] nebo prostaglandinů. U lidských neutrofilů hraje intaktní mitochondriální funkce důležitou roli v chemotaxi a fagocytóze, poškození těchto mechanismů vede ke snížené obranné schopnosti vůči mikrobiálním výzvám.

HIF-1α je transkripční faktor, který působí jako klíčový regulační faktor ve vývoji homeostázy kyslíku. Za normoxických podmínek je HIF-1α kontinuálně syntetizován a degradován po hydroxylaci dioxygenázami, které využívají jako substráty kyslík, Fe a α-ketoglutarát. Během hypoxie nízká dostupnost kyslíku omezuje reakci; HIF-1α již není degradován a rychle se hromadí a spouští transkripci genů zapojených do homeostázy kyslíku, jako jsou glykolytické enzymy, transportéry glukózy, vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) a erytropoetin. Za hypoxických podmínek zprostředkovává HIF také pokles hladin mRNA proteinů dýchacího řetězce, připravuje buňku na produkci ATP hlavně z glykolýzy a ne z oxidativní fosforylace, čímž optimalizuje buněčnou energetiku a homeostázu pro přežití a funkci během hypoxie.

Nedávné publikované zprávy spojují zánět a stimulaci endotoxinu s aktivací HIF-la. Bylo ukázáno, že HIF-la je up-regulován a stabilizován v LPS-ošetřených makrofázích a monocytech za normoxických podmínek. Ukázalo se, že hladiny HIF-la jsou sníženy u makrofágů s deficitem TLR4 po stimulaci LPS, což naznačuje, že LPS stimulace HIF-1a je zprostředkována TLR4.

Údaje o mitochondriální funkci lidských imunitních buněk u těžké sepse jsou omezené a potenciální korelace mezi požadavky na mitochondriální energii a produkcí a závažností pacientova stavu a výsledkem není dobře stanovena. Imunologická reakce v kontextu těžké sepse a septického šoku sestává ze vzájemně závislého, vysoce komplexního systému, který zahrnuje různé typy imunitních buněk a prozánětlivé a protizánětlivé cytokiny zapojené do časově závislého procesu. Jednoduché in-vitro studie hodnotící mitochondriální funkci jednoho typu imunitních buněk a jednotlivých cytokinů pouze v jednom časovém okamžiku v průběhu septického procesu nemusí být vhodným modelem pro zrcadlení komplexních interakcí imunitního systému. Sériová měření mitochondriální funkce různých klíčových buněk a specifických pro- a protizánětlivých cytokinů a markerů apoptózy paralelně s jinými klinickými a laboratorními markery sepse mohou nabídnout hlubší hodnocení a pochopení tohoto vzorce škodlivého onemocnění.

Objektivní

Cílem projektu je komplexně prozkoumat změny mitochondriální funkce a morfologie imunitních buněk u pacientů s těžkou sepsí a septickým šokem. Plánujeme posoudit změny mitochondriální funkce monocytů, B buněk a CD4+ T buněk v korelaci s hladinami různých cytokinů a klasickými klinickými a laboratorními parametry závažnosti sepse a výsledku.

Metody

Po získání písemného informovaného souhlasu pacienta nebo jeho nejbližších bude do studie zařazeno celkem 30 pacientů přijatých na jednotku intenzivní péče (JIP) nemocnice terciární péče z důvodu těžké sepse nebo septického šoku. Pacienti s jakýmkoli typem chronického infekčního, zánětlivého nebo autoimunitního onemocnění, po transplantacích nebo užívající imunosupresiva jsou vyloučeni.

Kontroly: 30 zdravých dobrovolníků Hodnocení mitochondriální funkce monocytů/granulocytů bude provedeno měřením aktivity mitochondriálního komplexu pomocí standardního titračního protokolu pro měření aktivace komplexu I až IV. K měření sérových hladin IL-1, IL-6, IL-10 a TNF budou použity standardní komerční kity.