Metylacja DNA i autoimmunologiczne choroby tarczycy (THYRODNA)

Wiadomo, że zapalenie tarczycy Hashimoto (HT) i choroba Gravesa-Basedowa (GD) są spowodowane nieprawidłową odpowiedzią immunologiczną przeciwko własnym komórkom i tkankom. HT obejmuje komórkową autoimmunologiczną destrukcję tarczycy prowadzącą do niedoczynności tarczycy. GD jest spowodowana procesem, w którym komórki odpornościowe wytwarzają stymulujące przeciwciała przeciwko receptorowi hormonu tyreotropowego (TSH) w tarczycy, co prowadzi do nadczynności tarczycy. Chociaż istnieją istotne dowody na to, że czynniki genetyczne zwiększają ryzyko rozwoju chorób autoimmunologicznych, bliźnięta monozygotyczne nadal pozostają niezgodne z chorobą (zgodność choroby nigdy nie wynosi 100%), co sugeruje rolę czynników środowiskowych i epigenetyki.

Epigenetyka to nowa dziedzina biologii badająca mechanizmy interakcji środowiska z genotypem w celu wytworzenia różnych fenotypów poprzez modyfikacje chromatyny, które nie zmieniają bezpośrednio sekwencji DNA. Modyfikacje te są związane ze zmienioną ekspresją genów i wyciszaniem powtarzających się elementów i mogą być dziedziczone mitotycznie. Mechanizmy epigenetyczne obejmują metylację DNA, modyfikacje histonów lub regulację potranskrypcyjną miRNA. Metylacja DNA obejmuje kowalencyjne dodanie grupy metylowej do pozycji węgla-5 w dinukleotydzie CpG z donora grupy metylowej S-adenozylometioniny i odbywa się za pośrednictwem grupy enzymów zwanych metylotransferazami DNA (DNMT). Dinukleotydy CpG są zazwyczaj zgrupowane razem w regionach znanych jako CGI (wyspy). CGI można znaleźć w regionach promotorowych genów, a metylacja CpG tych promotorów genów jest związana z wyciszeniem transkrypcji. W przeciwieństwie do tego stwierdzono, że hipermetylowane geny są aktywne transkrypcyjnie.

Jak dotąd opublikowano bardzo ograniczoną liczbę badań epigenetycznych dotyczących pacjentów z HT i GD. Dlatego celem tego badania jest analiza stanu metylacji DNA w białych krwinkach (WBC) w regionach promotorowych miejsc genomowych, które zostały wcześniej zidentyfikowane jako loci lub miejsca podatności na autoimmunologiczne choroby tarczycy, takie jak CD40L, FOXP3, CTLA4 , geny PTPN22, IL2RA, FCRL3 i HLADRB1.

Na początku zostanie przeprowadzona rekrutacja pacjentów i grupy kontrolnej oraz pobranie próbek krwi. Pełne badanie fizykalne zostanie również przeprowadzone u wszystkich uczestników włączonych do badania, a przed włączeniem zostanie również uzyskana szczegółowa historia osobista, rodzinna, ciążowa i okołoporodowa. Próbki krwi od wszystkich uczestników zostaną pobrane i odwirowane, a następnie białe krwinki (WBC), osocze i surowica zostaną oddzielone i przechowywane w głębokiej zamrażarce.

Później nastąpią analizy laboratoryjne. DNA zostanie wyizolowane z leukocytów obwodowych przy użyciu zestawu QIAamp DNA Blood Mini Kit, zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie zostanie potraktowany wodorosiarczynem sodu przy użyciu zestawu Zymo EZ DNA Methylation-Gold Kit, ponownie zgodnie z protokołem producenta. Dlatego niemetylowane cytozyny zostaną przekształcone w uracyle, podczas gdy metylowane cytozyny pozostaną niezmienione. Kwantyfikacja statusu metylacji DNA w badanych regionach promotora genu zostanie przeprowadzona przy użyciu specyficznych starterów wykrywających zmodyfikowany DNA, metodą PCR w czasie rzeczywistym i analizie krzywych topnienia wybranych fragmentów DNA. Amplikony będą również analizowane za pomocą elektroforezy i wizualizowane za pomocą transiluminacji ultrafioletowej.

Zbudowana zostanie elektroniczna Baza Danych i nastąpi Analiza Statystyczna. Wyniki i wnioski zostaną opublikowane w recenzowanych czasopismach i zaprezentowane na spotkaniach międzynarodowych.