Metilação do DNA e Doenças Autoimunes da Tireoide (THYRODNA)

Sabe-se que a tireoidite de Hashimoto (TH) e a doença de Graves (DG) são causadas por uma resposta imune anormal contra células e tecidos próprios. A HT envolve uma destruição autoimune da tireoide mediada por células, levando ao hipotireoidismo. A DG é causada por um processo no qual as células imunes produzem anticorpos estimulantes contra o receptor do hormônio estimulante da tireoide (TSH) na glândula tireoide, levando assim ao hipertireoidismo. Embora haja evidências substanciais de que os fatores genéticos aumentam o risco de desenvolver doenças autoimunes, gêmeos monozigóticos ainda permanecem discordantes para a doença (a concordância da doença nunca é 100%), sugerindo assim um papel para fatores ambientais e epigenéticos.

A epigenética é um novo campo da biologia que estuda os mecanismos pelos quais o ambiente interage com o genótipo para produzir uma variedade de fenótipos por meio de modificações na cromatina que não alteram diretamente a sequência do DNA. Essas modificações têm sido associadas à expressão gênica alterada e ao silenciamento de elementos repetitivos e podem ser herdadas mitoticamente. Mecanismos epigenéticos incluem metilação do DNA, modificações de histonas ou regulação pós-transcricional de miRNA. A metilação do DNA envolve a adição covalente de um grupo metil à posição do carbono 5 no dinucleotídeo CpG do doador de metil S-adenosilmetionina e é mediada por um grupo de enzimas chamadas DNA metiltransferases (DNMTs). Os dinucleotídeos CpG são tipicamente agrupados em regiões conhecidas como CGIs (ilhas). Os CGIs podem ser encontrados nas regiões promotoras de genes, e a metilação CpG desses promotores de genes está associada ao silenciamento transcricional. Em contraste, descobriu-se que os genes hipermetilados são transcricionalmente ativos.

Até o momento, um número muito limitado de estudos epigenéticos foi publicado em pacientes com HT e DG. Portanto, o objetivo deste estudo é analisar o estado de metilação do DNA em glóbulos brancos (WBCs) dentro das regiões promotoras de sítios genômicos que foram previamente identificados como loci de suscetibilidade ou sítios para doenças autoimunes da tireoide, como CD40L, FOXP3, CTLA4 , genes PTPN22, IL2RA, FCRL3 e HLADRB1.

Inicialmente, será feito o recrutamento de pacientes e controles, bem como a coleta de amostras de sangue. Um exame físico completo também será realizado em todos os participantes incluídos no estudo, e uma história pessoal, familiar, gestacional e perinatal detalhada será obtida também antes da inclusão. Amostras de sangue de todos os participantes serão coletadas e centrifugadas e, em seguida, glóbulos brancos (leucócitos), plasma e soro serão separados e armazenados em freezer.

As análises laboratoriais seguirão. O DNA será isolado de leucócitos periféricos utilizando o QIAamp DNA Blood Mini Kit, de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, será tratado com bissulfito de sódio usando o kit Zymo EZ DNA Methylation-Gold, novamente de acordo com o protocolo do fabricante. Portanto, as citosinas não metiladas serão convertidas em uracilos, enquanto as citosinas metiladas permanecerão inalteradas. Será feita a quantificação do estado de metilação do DNA nas regiões promotoras do gene em estudo, utilizando primers específicos que detectam DNA modificado, por PCR em tempo real e análise das curvas de fusão dos fragmentos de DNA selecionados. Amplicons também serão analisados ​​por eletroforese e visualizados por transiluminação ultravioleta.

Uma Base de Dados eletrônica será construída e a Análise Estatística seguirá. Os Resultados e Conclusões serão publicados em revistas especializadas e apresentados em Encontros Internacionais.