Methylace DNA a autoimunitní onemocnění štítné žlázy (THYRODNA)

Je známo, že Hashimotova tyreoiditida (HT) a Gravesova choroba (GD) jsou způsobeny abnormální imunitní reakcí proti vlastním buňkám a tkáním. HT zahrnuje buněčně zprostředkovanou autoimunitní destrukci štítné žlázy vedoucí k hypotyreóze. GD je způsobena procesem, při kterém imunitní buňky vytvářejí stimulující protilátky proti receptoru hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH) na štítné žláze, což vede k hypertyreóze. Ačkoli existují podstatné důkazy o tom, že genetické faktory zvyšují riziko rozvoje autoimunitních onemocnění, monozygotní dvojčata stále zůstávají v rozporu s onemocněním (shoda onemocnění není nikdy 100 %), což naznačuje roli faktorů prostředí a epigenetiky.

Epigenetika je nový obor biologie, který studuje mechanismy, kterými prostředí interaguje s genotypem za vzniku různých fenotypů prostřednictvím modifikací chromatinu, které přímo nemění sekvenci DNA. Tyto modifikace byly spojeny se změněnou genovou expresí a umlčením repetitivních prvků a mohou být zděděny mitoticky. Mezi epigenetické mechanismy patří methylace DNA, modifikace histonů nebo post-transkripční regulace miRNA. Methylace DNA zahrnuje kovalentní adici methylové skupiny na pozici uhlíku-5 v dinukleotidu CpG z donoru methylu S-adenosylmethionin a je zprostředkována skupinou enzymů nazývaných DNA methyltransferázy (DNMT). CpG dinukleotidy jsou typicky seskupeny v oblastech známých jako CGI (ostrovy). CGI lze nalézt v promotorových oblastech genů a CpG methylace těchto genových promotorů je spojena s umlčováním transkripce. Naproti tomu bylo zjištěno, že hypermethylované geny jsou transkripčně aktivní.

U pacientů s HT a GD bylo dosud publikováno velmi omezené množství epigenetických studií. Účelem této studie je proto analyzovat stav metylace DNA v bílých krvinkách (WBC) v promotorových oblastech genomových míst, která byla dříve identifikována jako lokusy citlivosti nebo místa pro autoimunitní onemocnění štítné žlázy, jako jsou CD40L, FOXP3, CTLA4 , PTPN22, IL2RA, FCRL3 a HLADRB1 geny.

Zpočátku bude proveden nábor pacientů a kontrol a také odběr vzorků krve. U všech účastníků zahrnutých do studie bude také provedeno kompletní fyzikální vyšetření a před zařazením bude rovněž získána podrobná osobní, rodinná, gestační a perinatální anamnéza. Vzorky krve od všech účastníků budou odebrány a odstředěny a poté budou odděleny bílé krvinky (WBC), plazma a sérum a uloženy v mrazáku.

Následovat budou laboratorní rozbory. DNA bude izolována z periferních leukocytů pomocí sady QIAamp DNA Blood Mini Kit podle pokynů výrobce. Poté bude ošetřen hydrogensiřičitanem sodným pomocí sady Zymo EZ DNA Methylation-Gold Kit, opět podle protokolu výrobce. Proto se nemethylované cytosiny přemění na uracyly, zatímco methylované cytosiny zůstanou nezměněny. Kvantifikace metylačního stavu DNA ve studovaných oblastech genového promotoru bude provedena pomocí specifických primerů, které detekují modifikovanou DNA, pomocí PCR v reálném čase a analýzou křivek tání vybraných fragmentů DNA. Amplikony budou také analyzovány elektroforézou a vizualizovány ultrafialovým transiluminací.

Bude vybudována elektronická databáze a následovat bude statistická analýza. Výsledky a závěry budou publikovány v odborných časopisech a prezentovány na mezinárodních setkáních.