Bezpieczeństwo Bifidobacterium Breve PS1 dla niemowląt

Wprowadzenie Niektóre okoliczności okołoporodowe, takie jak sposób porodu, mogą zmienić skład mikroflory jelitowej niemowlęcia. Na przykład niemowlęta urodzone przez cesarskie cięcie są podatne na dysbiozę jelitową (w tym niedobór bifidobakterii) w porównaniu z dziećmi urodzonymi drogą pochwową, co prowadzi do zwiększonej częstości infekcji przewodu pokarmowego i dróg oddechowych. Co ciekawe, karmienie piersią może przywrócić populację Bifidobacterium, co z kolei wiązało się ze spadkiem częstości różnych infekcji.

Pomimo ważnych funkcji, jakie bifidobakterie mogą pełnić w jelitach niemowląt, niektóre badania wykazały, że bakterie te mogą być obecne w niskim stężeniu lub nawet nieobecne u niektórych niemowląt. Niektóre czynniki, w tym brak karmienia piersią, wczesne odstawienie od piersi, antybiotykoterapia matki/dziecka lub skład HMO mogą działać przeciwko bifidobakterii w diadzie matka-niemowlę. Dlatego istnieje potrzeba opracowania strategii rozwoju żywności funkcjonalnej, w tym preparatów dla niemowląt, w celu dostarczenia szczepów bifidobakterii naturalnie obecnych w mleku kobiecym niemowlętom, które mogą być pozbawione takich drobnoustrojów. W tym kontekście celem niniejszej pracy było, po pierwsze, scharakteryzowanie potencjalnych właściwości probiotycznych szczepu bifidobakterii wyizolowanego z mleka kobiecego, a następnie zbadanie jego bezpieczeństwa i tolerancji w populacji 3-miesięcznych dzieci karmionych mlekiem modyfikowanym niemowlęta

Materiały i metody Projekt badania Przeprowadzono randomizowane, podwójnie zaślepione, kontrolowane badanie interwencyjne z udziałem dwóch grup badawczych. Zdrowe, trzymiesięczne niemowlęta, które z wyboru matek od urodzenia były karmione wyłącznie mlekiem modyfikowanym, włączono do badania po uzyskaniu świadomej pisemnej zgody rodziców. Śledczy zachowali szczególne środki ostrożności i staranności podczas całej komunikacji z rodzinami, aby wspierać i chronić, a nie zniechęcać do karmienia piersią i sugerować karmienie butelką rodzicom dziecka karmionego piersią. Kryteria wykluczenia obejmowały historię łagodnych lub poważnych zaburzeń żołądkowo-jelitowych (przewlekła biegunka lub zaparcia w wywiadzie, refluks żołądkowo-przełykowy), operacje przewodu pokarmowego, alergię na białko mleka krowiego, zaburzenia metaboliczne (cukrzyca, nietolerancja laktozy), niedobór odporności, przepisanie antybiotyku trzy tygodnie przed włączenie i wcześniejsze stosowanie preparatu zawierającego probiotyk. Kryteriami wykluczenia podczas badania były: nieprzestrzeganie protokołu badania, zdarzenia niepożądane związane ze spożyciem badanej formuły, niestawienie się na zaplanowane wizyty w poradni podstawowej opieki zdrowotnej oraz ciężkie zarzucanie i/lub kolka, które zdaniem pediatrów wymagały recepty o specjalnej formule.

Protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyki Szpitala Clínico (Madryt, Hiszpania) (Referencja 10/017-E).

Wielkość próby Wielkość próby oszacowano na podstawie pierwotnego wyniku średniego przyrostu masy ciała niemowląt między wizytą wyjściową a pierwszą wizytą (180 ± 5 dni życia). W oparciu o wcześniejsze publikacje, w których wzrost był główną zmienną wynikową w ramach badania bezpieczeństwa, badanie zostało zaprojektowane tak, aby miało moc wykrywania różnicy w przyroście masy ciała równej 0,5 odchylenia standardowego. Tak więc, przy założeniu non-inferiority (test jednostronny), w każdej grupie formułowej potrzebnych byłoby co najmniej 65 dzieci, przy poziomie istotności 2,5% i mocy 80%.

Formuła badania Łącznie 187 niemowląt (w wieku 3 miesięcy) zostało włączonych do badania i losowo przydzielonych do dwóch grup badawczych (grupa probiotyczna [PG] i grupa kontrolna [CG]), zgodnie z randomizacją wygenerowaną przez program komputerowy. Niemowlęta otrzymywały jedno z następujących mieszanek: (a) CG: standardowe mleko modyfikowane w proszku dla niemowląt (HiPP 1, 600 g) o składzie żywieniowym zgodnym z obowiązującymi przepisami UE oraz (b) PG: to samo mleko modyfikowane z dodatkiem B. breve PS1 w stężeniu dawki 107 jtk/g preparatu. B. breve PS1 wyprodukowano w zakładach Biopolis (Walencja, Hiszpania). Niemowlęta spożywały obie mieszanki do 6. miesiąca życia (3-miesięczny okres interwencji).

Stężenie probiotyku w preparacie zostało przeanalizowane i potwierdzone przed i po zakończeniu badania. Oryginalna mieszanka dla niemowląt HiPP została zakupiona i przygotowana do odpowiedniego użycia w podwójnie ślepej próbie interwencyjnej. Dlatego formułę proszku przeniesiono do zwykłych, białych, nierozróżnialnych puszek i podzbiór uzupełniono szczepem PS1.

Przygotowanie obu preparatów wykonano w pomieszczeniu czystym wyposażonym w aseptyczne urządzenie do pakowania na terenie Zakładu. Farmacji Galenowej i Technologii Żywności Uniwersytetu Complutense w Madrycie. Cały personel badawczy (pediatrzy i naukowcy) oraz rodzice byli zaślepieni przez cały okres badania. Przydział do grupy został ujawniony dopiero po zakończeniu analizy statystycznej. Pediatrzy przepisali dzienne dawki mleka modyfikowanego, które należy podawać niemowlętom zgodnie z wytycznymi ESPGHAN.

Wyniki badania Niemowlęta miały przejść dwie oceny kliniczne w okresie interwencji: na początku badania (w wieku 3 miesięcy) i na koniec badania (w wieku 6 miesięcy). Pierwszorzędowym wynikiem badania był średni przyrost masy ciała między oceną wyjściową a 6 miesiącem życia. Drugorzędowe wyniki obejmowały przyrost średniej długości i obwodu głowy, zdarzenia niepożądane związane ze spożyciem formuły, poziomy bifidobakterii w kale i stężenie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) w kale.

Pobieranie i analiza próbek kału Próbki kału pobrano z pieluchy podczas obu wizyt badawczych. Każdą próbkę kału od każdego uczestnika i czas pobierania podzielono na cztery części, przechowywano w temperaturze -20°C i przetwarzano w ciągu 1 tygodnia. Trzy porcje wykorzystano do oceny określonych parametrów badania, a pozostałą czwartą porcję przechowywano w temperaturze -80°C.

Oznaczenie ilościowe bifidobakterii w kale przeprowadzono przez wysianie dziesiętnych rozcieńczeń próbek na płytki MRS uzupełnione płytkami agarowymi z L-cysteiną (0,5 g/l) (MRS-Cys), które inkubowano beztlenowo (85% azotu, 10% wodoru, 5% dwutlenek węgla) w beztlenowej stacji roboczej (MINI-MACS; DW Scientific, Shipley, Wielka Brytania) przez 72 godziny w temperaturze 37ºC. Wyliczenie obejmowało kolonie, które odpowiadały Gram-dodatnim katalazo-ujemnym i F6PPK-dodatnim. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe DNA B. breve w próbkach kału przeprowadzono metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej.

W celu oznaczenia ilościowego krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), próbki kału homogenizowano z 150 mM NaHCO3 (pH 7,8) (1:5, wag./obj.) w atmosferze argonu. Próbki inkubowano do fermentacji przez 24 godziny w 37°C i przechowywano w -80°C do czasu ekstrakcji. Ekstrakcję SCFA przeprowadzono metodą chromatografii gazowej.

Analiza statystyczna Dane ilościowe wyrażono opisowo jako średnią i odchylenie standardowe (SD). Gdy rozkład nie był normalny, dane przedstawiono jako medianę i rozstęp międzykwartylowy (IQR).

Dane z pomiarów antropometrycznych podsumowano za pomocą średniej i odchylenia standardowego (SD), podczas gdy liczbę bakterii jelitowych podsumowano za pomocą mediany i rozstępu międzykwartylowego (IQR). Ponadto pomiary antropometryczne zostały przekonwertowane na z-score znormalizowane pod względem wieku i płci przy użyciu metodologii zalecanej przez WHO i zaimplementowanej w pakiecie R anthro w wersji 1.0.0. Następnie zastosowano test t-studenta do porównania średnich wyników z w grupie leczonej dla masy ciała, długości i obwodu głowy w 6-miesięcznym punkcie czasowym. Liczbę bakterii jelitowych porównano za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya-U. Testy przeprowadzono na poziomie istotności dwustronnej 5%, a dla oszacowań uzyskano 95% przedziały ufności. Dla wszystkich porównań różnice uznano za istotne przy p<0,05. Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu wersji R 4.2.1