ビフィズス菌ブレーベPS1の乳児に対する安全性

はじめに 出生形態などの周産期の状況によっては、乳児の腸内細菌叢の構成が変化する可能性があります。 一例として、帝王切開で生まれた乳児は、経膣分娩で生まれた乳児と比較して、腸内細菌叢異常（ビフィズス菌の減少を含む）になりやすく、胃腸および気道の感染症の発生率の増加につながります。 興味深いことに、母乳育児はビフィズス菌の数を回復させることができ、それがさまざまな感染症の発症率の低下と関連していました。

ビフィズス菌は乳児の腸内で重要な機能を果たしているにもかかわらず、一部の乳児ではこれらの菌が低濃度で存在するか、存在しない可能性があることがいくつかの研究で示されています。 母乳育児の欠如、早期の離乳、母子の抗生物質療法、HMO 組成などのいくつかの要因が、母子双生体内のビフィズス菌を選択する可能性があります。 したがって、母乳中に天然に存在するビフィズス菌株を、そのような微生物を与えられない可能性のある乳児に提供するための、乳児用調製粉乳を含む機能性食品を開発する戦略が必要である。 これに関連して、この研究の目的は、まず母乳から分離されたビフィズス菌株の潜在的なプロバイオティクス特性を特徴づけること、そして次に、粉ミルクで育てられた生後 3 か月の集団におけるその安全性と耐性をテストすることでした。幼児

材料と方法 研究デザイン 2 つの研究グループによるランダム化二重盲検対照介入研究を実施しました。 母親の選択により、出生時から粉ミルクのみで育てられた健康な生後3か月の乳児が、両親から書面によるインフォームドコンセントを得た後に研究に参加した。 調査員らは家族とのコミュニケーションを通じて、母乳育児を妨げないように、また母乳育児を妨げないように、また母乳育児の親に哺乳瓶での授乳を勧めないように、家族とのコミュニケーションを通じて特別な予防策と注意を払った。 除外基準には、軽度または重度の胃腸障害の病歴（慢性下痢または便秘の病歴、胃食道逆流症）、胃腸の手術、牛乳タンパク質アレルギー、代謝障害（糖尿病、乳糖不耐症）、免疫不全、3週間前の抗生物質の処方が含まれていました。プロバイオティクスを含む処方の包含と以前の使用。 研究中の除外基準は、研究プロトコールの遵守の欠如、研究用処方の摂取に関連する有害事象、プライマリケアセンターへの予定された訪問への欠席、および小児科医によると処方が必要な重度の逆流および/または疝痛であった。特殊な配合の。

このプロトコールは、病院クリニック (スペイン、マドリード) の倫理委員会によって承認されました (参照 10/017-E)。

サンプルサイズ サンプルサイズは、ベースライン訪問と訪問 1 (生後 180 ± 5 日) の間の乳児の平均体重増加の主要結果に基づいて推定されました。 安全性研究の一環として成長が主な結果変数であった以前の出版物に基づいて、この研究は標準偏差 0.5 に等しい体重増加の差を検出する検出力を持つように設計されました。 したがって、非劣性の仮定（片側検定）、有意水準 2.5%、検出力 80% を仮定すると、各粉ミルクグループに少なくとも 65 人の子供が必要になります。

研究公式 合計 187 人の乳児 (生後 3 か月) が登録され、コンピューター プログラムによって生成された無作為化に従って、2 つの研究グループ (プロバイオティクス グループ [PG] と対照グループ [CG]) に無作為に割り付けられました。 乳児には以下の粉ミルクのいずれかを与えた：（a）CG：現在のEU規制に従った栄養成分を含む標準的な乳児用粉ミルク（HiPP 1、600g）、（b）PG：同じ粉ミルクにB.ブレーベを添加したもの107 cfu/g 処方の濃度用量の PS1。 B. ブレーベ PS1 は、Biopolis (スペイン、バレンシア) の施設で生産されました。 乳児は両方の粉ミルクを生後 6 か月まで摂取しました (介入期間は 3 か月)。

配合中のプロバイオティクスの濃度は、研究の前後に分析され、確認されました。 オリジナルの HiPP 乳児用粉ミルクは購入され、二重盲検介入試験で適切に使用できるように準備されました。 したがって、粉ミルクを無地の白い缶に移し、サブセットに PS1 株を補充しました。

両製剤の調製は、Dpt の設備にある無菌包装装置を備えたクリーンルームで行われました。マドリードのコンプルテンセ大学でガレヌス薬学および食品技術の博士号を取得。 すべての研究関係者（小児科医および研究者）および親は、研究期間全体を通じて盲検状態に保たれた。 グループの割り当ては、統計分析の完了後にのみ明らかになりました。 小児科医は、ESPGHAN ガイドラインに従って、乳児に投与する 1 日あたりの粉ミルクの量を処方しました。

研究結果 乳児は介入期間中、ベースライン時（生後 3 か月）と研究終了時（生後 6 か月）の 2 つの臨床評価を受ける予定でした。 この試験の主な結果は、ベースライン評価から生後6か月までの平均体重増加でした。 副次的アウトカムには、平均身長と頭囲の増加、粉ミルク摂取に関連する有害事象、糞便中のビフィズス菌レベル、および糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）濃度が含まれた。

糞便サンプルの収集と分析 両方の研究訪問時に、おむつから糞便サンプルを収集しました。 各参加者およびサンプリング時間からの各糞便サンプルは 4 つの部分に等分され、-20 °C で保存され、1 週間以内に処理されました。 定義された研究パラメータを評価するために 3 つのアリコートが使用され、残りの 4 番目のアリコートは -80 °C で保存されました。

糞便中のビフィズス菌の定量は、L-システイン (0.5 g/L) (MRS-Cys) を添加した MRS 寒天プレートにサンプルの 10 進希釈液をプレーティングし、嫌気状態 (85% 窒素、10% 水素、5%) でインキュベートすることによって実行されました。二酸化炭素) を嫌気性ワークステーション (MINI-MACS; DW Scientific、Shipley、英国) 内で 37 °C で 72 時間処理しました。 列挙には、グラム陽性カタラーゼ陰性および F6PPK 陽性に対応するコロニーが含まれていました。 糞便サンプル中の B. ブレーベ DNA の検出と定量は、前述のようにリアルタイム定量 PCR によって実行されました。

短鎖脂肪酸 (SCFA) の定量化のために、アルゴン雰囲気下で糞便サンプルを 150 mM NaHCO3 (pH 7.8) (1:5、wt/v) でホモジナイズしました。 サンプルは発酵のために 37°C で 24 時間インキュベートされ、抽出まで -80°C で保存されました。 ＳＣＦＡの抽出はガスクロマトグラフィーにより行った。

統計分析 定量的データは、平均および標準偏差 (SD) として記述的に表されました。 正規分布していない場合、データは中央値および四分位範囲 (IQR) として表示されました。

人体計測データは平均値と標準偏差 (SD) を使用して要約され、腸内細菌数は中央値と四分位範囲 (IQR) によって要約されました。 さらに、人体測定値は、WHO が推奨し、R パッケージ anthro バージョン 1.0.0 に実装された方法論を使用して、年齢と性別の標準化された Z スコアに変換されました。 次に、スチューデントの t 検定を使用して、6 か月の時点での体重、身長、頭囲の Z スコアの治療グループ別の平均を比較しました。 腸内細菌数は、Mann-Whitney-U ノンパラメトリック検定を使用して比較されました。 検定は両側 5% 有意水準で実行され、推定値に対して 95% 信頼区間が得られました。 すべての比較において、差は p< 0.05 で有意であるとみなされます。 統計分析は R バージョン 4.2.1 を使用して実行されました。