Segurança de Bifidobacterium Breve PS1 para bebês

Introdução Algumas circunstâncias perinatais, como o modo de nascimento, podem alterar a composição da microbiota intestinal infantil. Por exemplo, bebês nascidos por cesariana são propensos a disbiose intestinal (incluindo depleção de bifidobactérias) em comparação com aqueles nascidos por parto vaginal, levando a um aumento na taxa de infecções do trato gastrointestinal e respiratório. Curiosamente, a amamentação pode restaurar a população de Bifidobacterium, que por sua vez foi associada a uma diminuição na taxa de várias infecções.

Apesar das funções importantes que as bifidobactérias podem desempenhar no intestino infantil, alguns estudos mostraram que essas bactérias podem estar presentes em baixa concentração ou mesmo ausentes em alguns bebês. Alguns fatores, incluindo falta de amamentação, desmame precoce, antibioticoterapia materna/infantil ou composição de HMO podem selecionar contra bifidobactérias na díade mãe-bebê. Portanto, há uma necessidade de estratégias para desenvolver alimentos funcionais, incluindo fórmula infantil, para fornecer cepas de bifidobactérias naturalmente presentes no leite humano para bebês que podem ser privados de tais micróbios. Neste contexto, os objectivos deste trabalho foram, em primeiro lugar, caracterizar as potenciais propriedades probióticas de uma estirpe bifidobacteriana isolada do leite humano e, posteriormente, testar a sua segurança e tolerância numa população de 3 meses de idade alimentada com fórmula bebês

Materiais e Métodos Desenho do Estudo Foi realizado um estudo randomizado duplo-cego controlado de intervenção com dois grupos de estudo. Lactentes saudáveis ​​de três meses de idade, que por escolha de suas mães foram alimentados exclusivamente com fórmula desde o nascimento, foram recrutados para o estudo após consentimento informado por escrito dos pais. Os investigadores tomaram precauções e cuidados especiais ao longo de sua comunicação com as famílias, a fim de apoiar e proteger, e não desencorajar a amamentação, e não sugerir alimentação com mamadeira aos pais de um bebê amamentado. Os critérios de exclusão incluíram história de distúrbios gastrointestinais leves ou graves (história de diarreia ou constipação crônica, refluxo gastroesofágico), cirurgia gastrointestinal, alergia à proteína do leite de vaca, distúrbios metabólicos (diabetes, intolerância à lactose), deficiência imunológica, prescrição de antibióticos três semanas antes da inclusão e uso prévio de fórmula contendo probióticos. Os critérios de exclusão durante o estudo foram não cumprimento do protocolo do estudo, eventos adversos relacionados ao consumo da fórmula do estudo, não comparecimento às consultas agendadas na unidade básica de saúde e regurgitação e/ou cólicas graves que, segundo os pediatras, precisavam de prescrição de uma fórmula especial.

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Clínico (Madri, Espanha) (Referência 10/017-E).

Tamanho da amostra O tamanho da amostra foi estimado com base no resultado primário de ganho de peso médio de bebês entre a visita inicial e a visita 1 (180 ± 5 dias de idade). Com base em publicações anteriores em que o crescimento foi a principal variável de resultado como parte de um estudo de segurança, o estudo foi projetado para ter um poder de detectar uma diferença no ganho de peso igual a 0,5 desvios padrão. Assim, seriam necessárias pelo menos 65 crianças em cada grupo de fórmula sob a hipótese de não inferioridade (teste unilateral), com nível de significância de 2,5% e poder de 80%.

Fórmula do estudo Um total de 187 lactentes (3 meses de idade) foram inscritos e randomizados em dois grupos de estudo (grupo probiótico [PG] e grupo controle [GC]), de acordo com uma randomização gerada por um programa de computador. Os lactentes receberam uma das seguintes fórmulas: (a) GC: uma fórmula infantil em pó padrão (HiPP 1, 600 g) com uma composição nutricional de acordo com os regulamentos atuais da UE e (b) PG: a mesma fórmula suplementada com B. breve PS1 na dose de concentração de 107 ufc/g de fórmula. O B. breve PS1 foi produzido nas instalações de Biopolis (Valência, Espanha). Ambas as fórmulas foram consumidas pelos lactentes até os 6 meses de idade (3 meses de intervenção).

A concentração do probiótico na fórmula foi analisada e confirmada antes e ao final do estudo. A fórmula infantil HiPP original foi comprada e preparada para o uso apropriado em um estudo de intervenção duplo-cego. Portanto, o pó da fórmula foi transferido para latas brancas indistinguíveis e um subconjunto foi suplementado com a cepa PS1.

A preparação de ambas as fórmulas foi realizada em sala limpa provida de um dispositivo de embalagem asséptica nas instalações do Dpt. de Farmácia Galénica e Tecnologia Alimentar da Universidade Complutense de Madrid. Todo o pessoal do estudo (pediatras e pesquisadores), bem como os pais, foram mantidos cegos durante todo o período do estudo. A atribuição do grupo só foi revelada após a conclusão da análise estatística. Os pediatras prescreveram as quantidades de fórmula por dia a serem administradas aos lactentes seguindo as diretrizes da ESPGHAN.

Resultados do estudo Os bebês foram agendados para receber duas avaliações clínicas durante o período de intervenção: no início (3 meses de idade) e no final do estudo (6 meses de idade). O desfecho primário do estudo foi o ganho médio de peso entre a avaliação inicial e os 6 meses de idade. Os resultados secundários incluíram ganho médio de comprimento e perímetro cefálico, eventos adversos associados ao consumo de fórmula, níveis fecais de bifidobactérias e concentração fecal de ácidos graxos de cadeia curta (SCFA).

Coleta e análise de amostras fecais As amostras fecais foram coletadas da fralda em ambas as visitas do estudo. Cada amostra fecal de cada participante e o tempo de amostragem foram aliquotados em quatro partes, preservados a -20 °C e processados ​​em 1 semana. Três alíquotas foram usadas para avaliar os parâmetros de estudo definidos, e a quarta alíquota restante foi armazenada a -80 °C.

A quantificação bifidobacteriana nas fezes foi realizada por semeadura de diluições decimais das amostras em placas MRS suplementadas com placas de ágar L-cisteína (0,5 g/L) (MRS-Cys), que foram incubadas anaerobicamente (85% nitrogênio, 10% hidrogênio, 5% dióxido de carbono) em uma estação de trabalho anaeróbica (MINI-MACS; DW Scientific, Shipley, Reino Unido) por 72 h a 37ºC. A enumeração incluiu as colônias que correspondiam a Gram-positivos catalase-negativos e F6PPK-positivos. A detecção e quantificação do DNA de B. breve nas amostras fecais foi realizada por PCR quantitativo em tempo real conforme descrito anteriormente.

Para a quantificação dos ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), as amostras fecais foram homogeneizadas com NaHCO3 150 mM (pH 7,8) (1:5, peso/volume) em atmosfera de argônio. As amostras foram incubadas para fermentação durante 24 h a 37°C e armazenadas a -80°C até a extração. A extração do SCFA foi realizada por cromatografia gasosa.

Análise estatística Os dados quantitativos foram expressos descritivamente como média e desvio padrão (DP). Quando não distribuídos normalmente, os dados foram apresentados como mediana e intervalo interquartil (IQR).

Os dados das medidas antropométricas foram resumidos usando a média e desvio padrão (DP), enquanto as contagens bacterianas intestinais foram resumidas pela mediana e intervalo interquartil (IQR). Além disso, as medidas antropométricas foram convertidas em escores z padronizados por idade e sexo, utilizando a metodologia recomendada pela OMS e implementada no pacote R anthro versão 1.0.0. Em seguida, o teste t de Student foi usado para comparar as médias por grupo de tratamento das pontuações z para peso, comprimento e perímetro cefálico no período de 6 meses. As contagens bacterianas intestinais foram comparadas usando o teste não paramétrico Mann-Whitney-U. Os testes foram realizados ao nível de significância bilateral de 5% e os intervalos de confiança de 95% foram obtidos para as estimativas. Para todas as comparações, as diferenças foram consideradas significativas com p< 0,05. As análises estatísticas foram realizadas usando R versão 4.2.1