Sicurezza di Bifidobacterium Breve PS1 per neonati

Introduzione Alcune circostanze perinatali, come la modalità di nascita, possono alterare la composizione del microbiota intestinale infantile. Ad esempio, i bambini nati con taglio cesareo sono soggetti a disbiosi intestinale (compresa una deplezione di bifidobatteri) rispetto a quelli nati con parto vaginale, portando a un aumento del tasso di infezioni del tratto gastrointestinale e respiratorio. È interessante notare che l'allattamento al seno può ripristinare la popolazione di Bifidobacterium, che a sua volta è stata associata a una diminuzione del tasso di varie infezioni.

Nonostante le importanti funzioni che i bifidobatteri possono svolgere nell'intestino infantile, alcuni studi hanno dimostrato che questi batteri possono essere presenti a bassa concentrazione o addirittura assenti in alcuni neonati. Alcuni fattori, tra cui la mancanza di allattamento al seno, lo svezzamento precoce, la terapia antibiotica materno/infantile o la composizione di HMO possono selezionare contro i bifidobatteri nella diade madre-bambino. Pertanto, vi è la necessità di strategie per sviluppare alimenti funzionali, compreso il latte artificiale, per fornire ceppi bifidobatterici naturalmente presenti nel latte materno ai neonati che potrebbero essere privati ​​di tali microbi. In questo contesto, gli obiettivi di questo lavoro sono stati, in primo luogo, caratterizzare le potenziali proprietà probiotiche di un ceppo bifidobatterico isolato dal latte umano e, successivamente, testarne la sicurezza e la tolleranza in una popolazione di 3 mesi di età alimentata con formula neonati

Materiali e metodi Disegno dello studio È stato condotto uno studio di intervento controllato randomizzato in doppio cieco con due gruppi di studio. Neonati sani di tre mesi, che per scelta delle loro madri sono stati nutriti esclusivamente con formula fin dalla nascita, sono stati reclutati nello studio dopo aver ottenuto il consenso informato scritto dai genitori. Gli investigatori hanno preso precauzioni e cure speciali durante tutta la loro comunicazione con le famiglie al fine di sostenere e proteggere, e non scoraggiare l'allattamento al seno, e non suggerire l'allattamento artificiale ai genitori di un bambino allattato al seno. I criteri di esclusione includevano storia di disturbi gastrointestinali lievi o gravi (storia di diarrea cronica o stitichezza, reflusso gastroesofageo), chirurgia gastrointestinale, allergia alle proteine ​​del latte vaccino, disturbi metabolici (diabete, intolleranza al lattosio), deficienza immunitaria, prescrizione di antibiotici tre settimane prima inclusione e uso precedente di formule contenenti probiotici. I criteri di esclusione durante lo studio sono stati la mancata osservanza del protocollo dello studio, gli eventi avversi correlati al consumo della formula in studio, la mancata partecipazione alle visite programmate presso il centro di cure primarie e il grave rigurgito e/o coliche che, secondo i pediatri, necessitavano di prescrizione di una formula speciale.

Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico dell'Hospital Clínico (Madrid, Spagna) (Riferimento 10/017-E).

Dimensione del campione La dimensione del campione è stata stimata in base all'esito primario dell'aumento di peso medio dei neonati tra la visita di riferimento e la visita 1 (180 ± 5 giorni di età). Sulla base di pubblicazioni precedenti in cui la crescita era la variabile di esito primaria come parte di uno studio sulla sicurezza, lo studio è stato progettato per avere un potere di rilevare una differenza nell'aumento di peso pari a 0,5 deviazioni standard. Pertanto, sarebbero necessari almeno 65 bambini in ciascun gruppo formula nell'ipotesi di non inferiorità (test unilaterale), con un livello di significatività del 2,5% e una potenza dell'80%.

Formula di studio Un totale di 187 neonati (di 3 mesi) è stato arruolato e randomizzato in due gruppi di studio (gruppo probiotico [PG] e gruppo di controllo [CG]), secondo una randomizzazione generata da un programma informatico. I lattanti hanno ricevuto una delle seguenti formule: (a) CG: una formula per lattanti in polvere standard (HiPP 1, 600 g) con una composizione nutrizionale conforme alle normative UE vigenti e (b) PG: la stessa formula integrata con B. breve PS1 alla dose di concentrazione di 107 ufc/g di formula. B. breve PS1 è stato prodotto negli stabilimenti di Biopolis (Valencia, Spagna). Entrambe le formule sono state consumate dai neonati fino all'età di 6 mesi (periodo di intervento di 3 mesi).

La concentrazione del probiotico nella formula è stata analizzata e confermata prima e alla fine dello studio. Il latte artificiale HiPP originale è stato acquistato e preparato per l'uso appropriato in uno studio di intervento in doppio cieco. Pertanto, la formula in polvere è stata trasferita in semplici barattoli bianchi non distinguibili e un sottoinsieme è stato integrato con il ceppo PS1.

La preparazione di entrambe le formule è stata eseguita in una camera bianca dotata di un dispositivo di confezionamento asettico nelle strutture del Dpt. di Farmacia Galenica e Tecnologia Alimentare dell'Università Complutense di Madrid. Tutto il personale dello studio (pediatri e ricercatori) così come i genitori sono stati tenuti in cieco durante l'intero periodo di studio. L'assegnazione del gruppo è stata rivelata solo al completamento dell'analisi statistica. I pediatri hanno prescritto le quantità di latte artificiale al giorno da somministrare ai neonati seguendo le linee guida ESPGHAN.

Risultati dello studio I neonati dovevano ricevere due valutazioni cliniche durante il periodo di intervento: al basale (3 mesi di età) e alla fine dello studio (6 mesi di età). L'esito primario dello studio era l'aumento di peso medio tra la valutazione basale e i 6 mesi di età. Gli esiti secondari includevano lunghezza media e aumento della circonferenza cranica, eventi avversi associati al consumo di formula, livelli di bifidobatteri fecali e concentrazione fecale di acidi grassi a catena corta (SCFA).

Raccolta e analisi dei campioni fecali I campioni fecali sono stati raccolti dal pannolino durante entrambe le visite dello studio. Ogni campione fecale di ciascun partecipante e tempo di campionamento è stato aliquotato in quattro parti, conservato a -20 ° C ed elaborato entro 1 settimana. Sono state utilizzate tre aliquote per valutare i parametri di studio definiti e la restante quarta aliquota è stata conservata a -80 °C.

La quantificazione dei bifidobatteri nelle feci è stata eseguita placcando diluizioni decimali dei campioni su piastre MRS integrate con piastre di agar L-cisteina (0,5 g/L) (MRS-Cys), che sono state incubate anaerobicamente (85% azoto, 10% idrogeno, 5% anidride carbonica) in una stazione di lavoro anaerobica (MINI-MACS; DW Scientific, Shipley, Regno Unito) per 72 ore a 37ºC. L'enumerazione includeva le colonie che corrispondevano a Gram-positivi catalasi-negativi e F6PPK-positivi. La rilevazione e la quantificazione del DNA di B. breve nei campioni fecali è stata eseguita mediante PCR quantitativa in tempo reale come descritto in precedenza.

Per la quantificazione degli acidi grassi a catena corta (SCFA), i campioni fecali sono stati omogeneizzati con 150 mM NaHCO3 (pH 7,8) (1:5, wt/v) in atmosfera di argon. I campioni sono stati incubati per la fermentazione per 24 ore a 37°C e conservati a -80°C fino all'estrazione. L'estrazione di SCFA è stata eseguita mediante gascromatografia.

Analisi statistica I dati quantitativi sono stati espressi in modo descrittivo come media e deviazione standard (DS). Quando non sono distribuiti normalmente, i dati sono stati presentati come mediana e intervallo interquartile (IQR).

I dati delle misurazioni antropometriche sono stati riassunti utilizzando la media e la deviazione standard (SD), mentre i conteggi batterici intestinali sono stati riassunti in base all'intervallo mediano e interquartile (IQR). Inoltre, le misurazioni antropometriche sono state convertite in punteggi z standardizzati per età e sesso utilizzando la metodologia raccomandata dall'OMS e implementata nel pacchetto R anthro versione 1.0.0. Successivamente, il test t dello studente è stato utilizzato per confrontare le medie per gruppo di trattamento dei punteggi z per peso, lunghezza e circonferenza cranica al punto temporale di 6 mesi. Le conte batteriche intestinali sono state confrontate utilizzando il test non parametrico Mann-Whitney-U. I test sono stati eseguiti al livello di significatività bilaterale del 5% e sono stati ottenuti gli intervalli di confidenza del 95% per le stime. Per tutti i confronti, le differenze sono state considerate significative a p<0,05. Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando la versione R 4.2.1