短双歧杆菌 PS1 对婴儿的安全性

简介 一些围产期环境，例如出生方式，可以改变婴儿肠道微生物群的组成。 例如，与阴道分娩的婴儿相比，剖腹产出生的婴儿更容易出现肠道菌群失调（包括双歧杆菌耗竭），从而导致胃肠道和呼吸道感染的发生率增加。 有趣的是，母乳喂养可以恢复双歧杆菌数量，从而降低各种感染率。

尽管双歧杆菌可能在婴儿肠道中发挥重要功能，但一些研究表明，这些细菌在某些婴儿体内的浓度可能较低，甚至不存在。 一些因素，包括缺乏母乳喂养、早期断奶、母婴抗生素治疗或 HMO 组合物可能会选择不利于母婴二元中的双歧杆菌。 因此，需要开发功能性食品（包括婴儿配方奶粉）的策略，为可能缺乏此类微生物的婴儿提供母乳中天然存在的双歧杆菌菌株。 在这种背景下，这项工作的目标首先是表征从母乳中分离出的双歧杆菌菌株的潜在益生菌特性，随后在 3 个月大的配方奶喂养人群中测试其安全性和耐受性婴儿

材料和方法 研究设计 进行了两个研究组的随机双盲对照干预研究。 根据母亲的选择，健康的三个月大婴儿从出生起就完全采用配方奶喂养，在获得父母的书面知情同意后，他们被招募到研究中。 调查人员在与家人的沟通过程中采取了特殊的预防措施和护理，以支持和保护母乳喂养，而不是阻止母乳喂养，也不建议母乳喂养婴儿的父母进行奶瓶喂养。 排除标准包括轻度或严重胃肠道疾病史（慢性腹泻或便秘史、胃食管反流）、胃肠道手术、牛奶蛋白过敏、代谢性疾病（糖尿病、乳糖不耐受）、免疫缺陷、就诊前三周服用抗生素包含和以前使用过含益生菌的配方奶粉。 研究期间的排除标准是不遵守研究方案、与食用研究配方奶粉相关的不良事件、未按计划前往初级保健中心就诊以及根据儿科医生的说法需要处方的严重反流和/或绞痛的特殊配方。

该方案得到了 Hospital Clínico（西班牙马德里）伦理委员会的批准（参考文献 10/017-E）。

样本量 样本量是根据基线访视和访视 1（180 ± 5 天龄）之间婴儿平均体重增加的主要结果估计的。 根据之前的出版物，其中生长是安全研究的主要结果变量，该研究旨在能够检测体重增加的差异等于 0.5 个标准差。 因此，在非劣效性假设（单边检验）下，每个配方组至少需要 65 名儿童，显着性水平为 2.5%，功效为 80%。

研究配方 共有 187 名婴儿（3 个月大）被招募，并根据计算机程序生成的随机分组被随机分为两个研究组（益生菌组 [PG] 和对照组 [CG]）。 婴儿接受以下配方之一：(a) CG：标准婴儿配方奶粉（HiPP 1，600 克），其营养成分符合现行欧盟法规，以及 (b) PG：添加短双歧杆菌的相同配方奶粉PS1 的浓度剂量为 107 cfu/g 配方奶粉。 短双歧杆菌 PS1 在 Biopolis（西班牙巴伦西亚）的设施中生产。 婴儿一直食用这两种配方奶粉直至 6 个月大（3 个月的干预期）。

在研究之前和结束时对配方中益生菌的浓度进行了分析和确认。 购买原装 HiPP 婴儿配方奶粉并准备用于双盲干预试验中的适当使用。 因此，将配方粉末转移至纯白色、无法区分的罐中，并用菌株 PS1 补充一部分。

两种配方奶粉的制备均在该部门配备无菌包装装置的洁净室中进行。马德里康普顿斯大学盖伦制药和食品技术系。 在整个研究期间，所有研究人员（儿科医生和研究人员）以及家长均保持失明。 分组分配仅在统计分析完成后才公布。 儿科医生按照 ESPGHAN 指南规定了婴儿每天的配方奶粉量。

研究结果 婴儿计划在干预期间接受两次临床评估：基线时（3 个月大）和研究结束时（6 个月大）。 该试验的主要结果是基线评估和 6 个月龄之间的平均体重增加。 次要结果包括平均身长和头围增加、与配方奶粉消耗相关的不良事件、粪便双歧杆菌水平和粪便短链脂肪酸 (SCFA) 浓度。

粪便样本收集和分析 在两次研究访问中从尿布中收集粪便样本。 将每位参与者的粪便样本和采样时间分成四份，保存在-20°C 下，并在 1 周内处理。 三个等分试样用于评估定义的研究参数，剩余的第四个等分试样储存在-80°C。

粪便中的双歧杆菌定量通过将样品的十进稀释液铺在补充有 L-半胱氨酸 (0.5 g/L) (MRS-Cys) 琼脂平板上进行，该琼脂平板在厌氧条件下孵育（85% 氮气、10% 氢气、5%二氧化碳）在厌氧工作站（MINI-MACS；DW Scientific，Shipley，英国）中在 37°C 下培养 72 小时。 计数包括对应于革兰氏阳性过氧化氢酶阴性和F6PPK阳性的菌落。 如前所述，通过实时定量 PCR 进行粪便样品中短双歧杆菌 DNA 的检测和定量。

对于短链脂肪酸 (SCFA) 定量，粪便样品在氩气气氛中用 150 mM NaHCO3 (pH 7.8)（1:5，wt/v）均质化。 样品在 37°C 下发酵 24 小时，并在-80°C 下保存直至提取。 SCFA的提取通过气相色谱法进行。

统计分析定量数据描述性地表示为平均值和标准差(SD)。 当非正态分布时，数据以中位数和四分位数范围 (IQR) 的形式呈现。

使用平均值和标准差（SD）总结人体测量数据，而通过中位数和四分位数范围（IQR）总结肠道细菌计数。 此外，使用 WHO 推荐的方法将人体测量值转换为年龄和性别标准化 z 分数，并在 R 包 anthro 版本 1.0.0 中实施。 接下来，使用学生的 t 检验来比较治疗组在 6 个月时间点的体重、身长和头围 z 分数的平均值。 使用 Mann-Whitney-U 非参数检验比较肠道细菌计数。 测试在两侧 5% 显着性水平下进行，并获得了估计值的 95% 置信区间。 对于所有比较，p < 0.05 时差异被认为是显着的。 使用R版本4.2.1进行统计分析