Bronquiectasia em Pacientes com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC): Papel da Profilaxia

OBJETIVOS DO ESTUDO

Conforme descrito anteriormente, os objetivos do programa de pesquisa são os seguintes:

• definição da prevalência de bronquiectasias em pacientes acometidos por doença pulmonar obstrutiva crônica.
• Após a identificação dos pacientes com bronquiectasia, avaliaremos as implicações fisiopatológicas, características microbiológicas e inflamatórias deste subgrupo em comparação com pacientes não bronquiectasicos.
• Finalmente, a pesquisa abordará os efeitos de tratamentos de longo prazo com esteróides inalatórios e antibióticos na história natural da doença e suas implicações fisiopatológicas. Para tanto, o estudo será dividido em duas seções. Na I secção serão recrutados 400 doentes com DPOC. Nestes pacientes, pretendemos avaliar a prevalência de bronquiectasias por meio de tomografia computadorizada em espiral. Também detectaremos colonização bacteriana por PCR em tempo real e técnica ELIspot, e inflamação das vias aéreas por método não invasivo (condensado de ar exalado) comparando pacientes com e sem bronquiectasia.

Pacientes com DPOC com bronquiectasia:

Nesta população, estudaremos o efeito de diferentes "profilaxias", ou seja, macrolídeos e esteroides inalatórios.

Detalhes das intervenções propostas DPOC ESTÁVEL O paciente comparecerá à clínica pela manhã para inscrição e fornecerá consentimento informado por escrito. Durante a visita, o histórico médico será registrado e os indivíduos serão submetidos a um exame físico e testes de função pulmonar no início e após salbutamol 200 mcg. Também serão realizadas tomografia computadorizada, condensado da respiração exalada e venopunção. Amostras de escarro serão obtidas para avaliação da colonização bacteriana.

Avaliação Respiratória:

O teste de função pulmonar será realizado usando um pneumotacógrafo aquecido Fleish No. 3; as medidas pletismográficas, volume de gás torácico (TGV), volume residual (VR), capacidade pulmonar total (CPT), serão avaliadas usando um pletismógrafo corporal (Werner Gut, Basileia, Suíça) com compensação eletrônica BTPS a um volume constante (850L) . A determinação de DLCO será realizada.

Tomografia computadorizada Toda a tomografia computadorizada multislice (MSCT) realizada será analisada centralmente pelo UO 4 . O seguinte protocolo será seguido

1. MSCT em inspiração em CPT com corte de 1 mm a cada 10 + 3 cortes expiratórios em VD usando três níveis predeterminados (arco aórtico, carina traqueal, veia comum basal direita)
2. Parâmetros técnicos: 120 kV, 220 mA, filtro ósseo, FOV incluindo ambos os pulmões, janela de parênquima pulmonar (-600/1600 HU)
3. Todas as TCs serão salvas em CD-ROM Dois radiologistas irão analisar a mesma TC, todas as discrepâncias serão resolvidas por consenso

O diagnóstico e avaliação das bronquiectasias serão realizados de acordo com Webb et al. (1):

A avaliação será realizada lóbulo por lóbulo incluindo língula (lobos totais = 6)

1. extensão da bronquiectasia na base lobar: 0, 1 (< 25% do lóbulo), 2 (25-50%), 3 (>50%) - MAX TOT 18
2. gravidade e tipo de bronquiectasia e semiquantitativo, comparando o diâmetro com o da artéria adjacente: 0, 1 (diâmetro brônquico igual a 100-200% diâmetro da artéria), 2 (200-300%), 3 (> 300%) - MÁX TOT 18
3. Espessura das paredes brônquicas: 0, 1 (espessura < 50% do diâmetro da artéria), 2 (50-100%), 3 (obliteração completa do lúmen ou níveis de Hydro-air) - MAX TOT 18
4. Avaliação do enfisema (escore visual em três níveis (inspiração) (arco aórtico, carina, veia)
5. Avaliação do aprisionamento aéreo na expiração (idem)
6. bolhas
7. Áreas em vidro fosco (extensão por partitura visual)
8. bronquiolite: local prevalente, envolvimento lobar, gravidade (0,1,2,3)
9. Diâmetro da artéria pulmonar (patológico se > 2,9 cm)
10. Outras características

Condensado da respiração exalada:

O condensado da respiração exalada será coletado usando um condensador, que permite a coleta não invasiva de componentes não gasosos do ar expiratório (EcoScreen, Jaeger, Alemanha). Os indivíduos respiram correntemente através de um bocal conectado à entrada por 8 minutos enquanto usam um clipe nasal. O bocal também é usado como coletor de saliva. Aproximadamente 1 ml de condensado da respiração é coletado e armazenado a -70° C. IL-6, IL-8, TNF-a e cisteinil-leucotrienos (cys-LTs) serão medidos por imunoensaios enzimáticos específicos (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI). Além disso, a análise proteômica será realizada no subconjunto de pacientes inscritos pelo UO1 conforme relatado anteriormente (2); brevemente, eletroforese unidimensional e bidimensional serão realizadas e para avaliação qualitativa e análise por espectrometria de massas, os géis serão corados com nitrato de prata, com ou sem glutaraldeído na etapa de sensibilização e formaldeído na solução de impregnação. Os volumes pontuais serão calculados usando Image J 1.29x (W. Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) para géis unidimensionais e com PDQUEST (Biorad, Hercules, Califórnia) para géis bidimensionais.

Amostras de Soro:

Alíquotas de soro serão dispostas em duplicata e armazenadas a -20°C até o momento da análise. IL-6, IL-8, TNF-a e cisteinil-leucotrienos (cys-LTs) serão medidos por imunoensaios enzimáticos específicos (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).

A proteína C-reativa e a procalcitonina também serão dosadas.(3) UO 1 O ensaio ex-vivo Enzyme-Linked ImmunoSPOT (ELISPOT) é a ferramenta mais sensível para detectar e quantificar a resposta de células T antígeno-específicas e pode detectar e enumerar células T produzindo uma ou mais citocinas em resposta a antígenos específicos . Esta técnica já foi utilizada para detectar baixos números de células T antígeno-específicas em doenças infecciosas, com ênfase particular para patógenos intracelulares, como Mycobacterium tuberculosis. A técnica ELISPOT está se tornando uma referência padrão para o monitoramento de muitas doenças infecciosas, incluindo a infecção pelo HIV, e está se tornando cada vez mais usada em aplicações imunológicas clínicas avançadas, como a detecção de respostas imunes de células T antígeno-específicas a peptídeos oncogênicos.

No contexto do projeto proposto, a tecnologia ELISPOT será utilizada para detectar a presença de uma resposta antígeno-específica sistêmica (sangue) e local (lavagem broncoalveolar) usando pools de peptídeos de micobactérias não tuberculosas e outras bactérias intracelulares (como Mycoplasma pneumoniae ), bactérias (como Pseudomonas spp) e fungos (como espécies de Aspergillus). Os testes ELISPOT serão realizados em amostras de sangue total (após separação Ficoll de células mononucleares periféricas) e células broncoalveolares medindo o número de células T produtoras de interferon-gama após uma incubação noturna com pools de peptídeos antigênicos específicos. (4-8)

Coleta de escarro:

Uma amostra de escarro espontâneo será obtida de todos os pacientes. Alternativamente, escarro induzido de acordo com Pizzichini, et al (9) será coletado. Em resumo, o escarro induzido é obtido após a inalação de água salina hipertônica a 3% por 20 minutos usando um nebulizador ultrassônico (Ultraneb 2000; DeVilbiss Healthcare Inc, Somerset, PS, EUA). Somente amostras de escarro grau IV ou V de Murray-Washington classificação (10) será processada. Uma amostra de escarro será congelada a -70°C para detecção de DNA bacteriano por técnicas de PCR (análise qualitativa) e PCR em tempo real (análise quantitativa).

As seguintes bactérias serão detectadas usando o protocolo padrão em uso no UO1: H. influenzae, M. catarrhalis, S. pneumoniae, P.

aeruginosa, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae. Uma alíquota será cultivada usando técnicas microbiológicas padrão. Pacientes 400 pacientes serão recrutados nas UO 1,2,3 e 5. Todas as tomografias serão coletadas e examinadas na UO 4. A UO2 servirá como segundo observador de forma duplo-cega; qualquer discrepância será resolvida por consenso.

Um subgrupo de pacientes com DPOC estável (n=15) e um subgrupo de pacientes com DPOC e bronquiectasias (n=15) serão submetidos à broncoscopia com coleta de biópsia. Os indivíduos serão pré-medicados com atropina e anestesiados topicamente com lidocaína.

A broncoscopia será realizada com um broncoscópio de fibra óptica flexível. Biópsias brônquicas serão feitas através do broncoscópio com pinça padrão da carina do segmento basal do brônquio do lobo inferior direito. Desta área serão obtidos dois espécimes em cada paciente. As biópsias brônquicas obtidas serão preparadas para análise em microscopia eletrônica e de luz (UO3 e UO 1).

Tamanho da amostra: podemos esperar uma prevalência de pelo menos 30% de bronquiectasias, o que significa que 120 pacientes serão incluídos na segunda etapa do estudo (11)

PACIENTES COM DPOC COM BRONQUIECTASE:

Nesta população, estudaremos o efeito de diferentes "profilaxias", ou seja, macrolídeos e esteroides inalatórios. A população será acompanhada por 12 meses.

O seguinte procedimento será realizado a cada 3 meses e a cada exacerbação:

Avaliação clínica, Condensado do ar exalado, Amostragem de soro, Coleta de escarro.

Nas amostras biológicas serão realizadas todas as técnicas descritas anteriormente e testes de função renal e hepática (segurança).

A cultura de escarro será realizada para avaliar a flora bacteriana e os padrões de resistência.

Desenho do estudo:

120 pacientes serão randomizados em 3 grupos (40 pts) para receber:

1. padrão de atendimento
2. azitromicina 500 mg OD 3 dias por semana (segunda, quarta, sexta) por 6 meses e depois esteróides inalatórios (fluticasona 500 ug bid) por 6 meses
3. esteróides inalatórios (fluticasona 500 ug bid) por 6 meses e depois azitromicina 500 mg OD 3 dias por semana (segunda, quarta e sexta) por 6 meses

Pontos finais:

PRIMÁRIO

• efeitos dos tratamentos nos parâmetros de inflamação brônquica SECUNDÁRIO
• efeitos dos tratamentos na frequência das exacerbações
• efeitos dos tratamentos na função pulmonar

Tamanho da amostra:

Podemos esperar uma diferença de 40% entre pacientes tratados e não tratados para pelo menos um entre TNFa, IL6, IL8 e cisteinil-leucotrienos. Neste caso, precisamos de 35 pacientes tratados (para cada braço) e 35 pacientes não tratados para um erro alfa de 0,05 e um beta de 0,1.