Bronchiectasie nei pazienti con broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO): ruolo della profilassi

OBIETTIVI DELLO STUDIO

Come precedentemente descritto gli obiettivi del programma di ricerca sono i seguenti:

• definizione della prevalenza delle bronchiectasie nei pazienti affetti da broncopneumopatia cronica ostruttiva.
• Dopo l'identificazione dei pazienti con bronchiectasie, valuteremo le implicazioni fisiopatologiche e le caratteristiche microbiologiche e infiammatorie di questo sottogruppo rispetto ai pazienti senza bronchiectasie.
• Infine, la ricerca affronterà gli effetti dei trattamenti a lungo termine con steroidi inalatori e antibiotici sulla storia naturale della malattia e le loro implicazioni fisiopatologiche. A tal fine, lo studio sarà suddiviso in due sezioni. Nella I sezione verranno reclutati 400 pazienti con BPCO. In questi pazienti intendiamo valutare la prevalenza delle bronchiectasie mediante una scansione TC spirale. Rileveremo anche la colonizzazione batterica mediante PCR in tempo reale e tecnica ELIspot e l'infiammazione delle vie aeree mediante un metodo non invasivo (condensato del respiro espirato) confrontando pazienti con e senza bronchiectasie.

Pazienti con BPCO con bronchiectasie:

In questa popolazione studieremo l'effetto di diverse "profilassi", cioè macrolidi e steroidi inalatori.

Dettagli degli interventi proposti BPCO STABILE Il paziente si presenterà in clinica la mattina per l'arruolamento e fornirà il consenso informato scritto. Durante la visita verrà registrata la storia medica e i soggetti verranno sottoposti a un esame fisico e test di funzionalità polmonare al basale e dopo salbutamolo 200 mcg. Verranno inoltre eseguite la TAC, il condensato del respiro espirato e la venopuntura. Saranno ottenuti campioni di espettorato per la valutazione della colonizzazione batterica.

Valutazione respiratoria:

I test di funzionalità polmonare verranno eseguiti utilizzando uno pneumotacografo riscaldato Fleish n. 3; le misurazioni pletismografiche, volume gassoso toracico (TGV), volume residuo (RV), capacità polmonare totale (TLC), saranno valutate utilizzando un pletismografo corporeo (Werner Gut, Basilea, Svizzera) con compensazione elettronica BTPS a volume costante (850L) . Verrà eseguita la determinazione del DLCO.

TAC Tutte le TAC multistrato (MSCT) eseguite saranno analizzate centralmente dall'UO 4 . Sarà seguito il seguente protocollo

1. TCMS in inspirazione a TLC con slice di 1 mm ogni 10 + 3 slice espiratorie a RV utilizzando tre livelli prefissati (arco aortico, carena tracheale, vena comune basale destra)
2. Parametri tecnici: 120 kV, 220 mA, filtro osseo, FOV inclusi entrambi i polmoni, finestra del parenchima polmonare (-600/1600 HU)
3. Tutte le TC verranno salvate su CD rom Due radiologi analizzeranno la stessa TC, ogni discrepanza verrà risolta per consenso

La diagnosi e la valutazione delle bronchiectasie saranno eseguite secondo Webb et al. (1):

La valutazione verrà eseguita lobo per lobo compresa la lingula (totale lobi= 6)

1. estensione delle bronchiectasie su base lobare: 0, 1 (< 25% del lobo), 2 (25-50%), 3 (>50%) - MAX TOT 18
2. gravità e tipo di bronchiectasie e semi-quantitativo, confrontando il diametro con quello dell'arteria adiacente: 0, 1 (diametro bronchiale pari al 100-200% del diametro dell'arteria), 2 (200-300%), 3 (> 300%) - TOTALE MASSIMO 18
3. Spessore delle pareti bronchiali: 0, 1 (spessore < 50% diametro arteria), 2 (50-100%), 3 (completa obliterazione del lume o livelli idro-aria) - MAX TOT 18
4. Valutazione dell'enfisema (punteggio visivo su tre livelli (inspirazione) (arco aortico, carena, vena)
5. Valutazione dell'intrappolamento dell'aria in espirazione (idem)
6. Bolle
7. Aree a vetro smerigliato (estensione tramite partitura visiva)
8. bronchiolite: sede prevalente, interessamento lobare, gravità ( 0,1,2,3)
9. Diametro dell'arteria polmonare (patologico se > 2,9 cm)
10. Altre caratteristiche

Condensato del respiro espirato:

Il condensato del respiro espirato sarà raccolto utilizzando un condensatore, che consente la raccolta non invasiva di componenti non gassosi dell'aria espiratoria (EcoScreen, Jaeger, Germania). I soggetti respirano in modo ordinato attraverso un boccaglio collegato all'ingresso per 8 minuti mentre indossano una clip per il naso. Il boccaglio viene utilizzato anche come trappola per la saliva. Circa 1 ml di respiro condensato viene raccolto e conservato a -70° C. IL-6, IL-8, TNF-a e cisteinil-leucotrieni (cys-LTs) saranno misurati mediante specifici immunodosaggi enzimatici (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan). Inoltre l'analisi proteomica sarà effettuata sul sottogruppo di pazienti arruolati dall'UO1 come precedentemente riportato (2); brevemente, verranno eseguite elettroforesi unidimensionali e bidimensionali e per la valutazione qualitativa e l'analisi di spettrometria di massa, i gel saranno colorati con nitrato d'argento, con o senza glutaraldeide nella fase di sensibilizzazione e formaldeide nella soluzione di impregnazione. I volumi spot saranno calcolati utilizzando Image J 1.29x (W. Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) per gel unidimensionali e con PDQUEST (Biorad, Hercules, California) per gel bidimensionali.

Campioni di siero:

Le aliquote di siero saranno predisposte in duplicato e conservate a -20°C fino al momento dell'analisi. IL-6, IL-8, TNF-a e cisteinil-leucotrieni (cys-LTs) saranno misurati mediante immunodosaggi enzimatici specifici (EIA) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).

Saranno misurate anche la proteina C-reattiva e la procalcitonina.(3) UO 1 Il test ex-vivo Enzyme-Linked ImmunoSPOT (ELISPOT) è lo strumento più sensibile per rilevare e quantificare la risposta delle cellule T antigene-specifiche e può rilevare ed enumerare le cellule T che producono una o più citochine in risposta a specifici antigeni . Questa tecnica è già stata utilizzata per rilevare un basso numero di cellule T antigene-specifiche nei disturbi infettivi, con particolare attenzione ai patogeni intracellulari come Mycobacterium tuberculosis . La tecnica ELISPOT sta diventando un riferimento standard per il monitoraggio di molte malattie infettive, inclusa l'infezione da HIV, e sta diventando sempre più utilizzata in applicazioni immunologiche cliniche avanzate, come il rilevamento di una risposta immunitaria delle cellule T antigene-specifiche ai peptidi oncogeni.

Nell'ambito del progetto proposto, la tecnologia ELISPOT sarà utilizzata per rilevare la presenza di una risposta antigene-specifica sistemica (sangue) e locale (lavaggio broncoalveolare) utilizzando pool peptidici di micobatteri non tubercolari e altri batteri intracellulari (come Mycoplasma pneumoniae ), batteri (come Pseudomonas spp) e funghi (come Aspergillus spp). I test ELISPOT saranno eseguiti su campioni di sangue intero (dopo separazione Ficoll delle cellule mononucleate periferiche) e di cellule broncoalveolari misurando il numero di cellule T che producono interferone-gamma dopo una notte di incubazione con gli specifici pool di peptidi antigenici. (4-8)

Raccolta dell'espettorato:

Un campione di espettorato spontaneo sarà ottenuto da tutti i pazienti. In alternativa verrà raccolto espettorato indotto secondo Pizzichini, et al (9). In sintesi, l'espettorato indotto si ottiene dopo inalazione di acqua salina ipertonica al 3% per 20 minuti utilizzando un nebulizzatore ad ultrasuoni (Ultraneb 2000; DeVilbiss Healthcare Inc, Somerset, PS, USA). Solo campioni di espettorato di grado IV o V di Murray-Washington la classificazione (10) verrà elaborata. Un campione di espettorato verrà congelato a -70°C per il rilevamento del DNA batterico mediante tecniche di PCR (analisi qualitativa) e real time PCR (analisi quantitativa).

I seguenti batteri saranno rilevati utilizzando il protocollo standard in uso nell'UO1: H. influenzae, M. catarrhalis, S. pneumoniae, P.

aeruginosa, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae. Un'aliquota sarà coltivata utilizzando tecniche microbiologiche standard Pazienti 400 pazienti saranno reclutati presso le UO 1,2,3 e 5. Tutta la TAC sarà raccolta ed esaminata presso l'UO 4. L'UO 2 fungerà da secondo osservatore in doppio cieco; qualsiasi discrepanza sarà risolta per consenso.

Un sottogruppo di pazienti con BPCO stabile (n=15) e un sottogruppo di pazienti con BPCO e bronchiectasie (n=15) saranno sottoposti a broncoscopia con prelievo bioptico. I soggetti saranno premedicati con atropina e anestetizzati localmente con lidocaina.

La broncoscopia sarà eseguita con un broncoscopio a fibre ottiche flessibile. Le biopsie bronchiali saranno prelevate attraverso il broncoscopio con pinze standard dalla carena del segmento basale del bronco del lobo inferiore destro. Da quest'area verranno prelevati due campioni per ogni paziente. Le biopsie bronchiali ottenute saranno preparate per l'analisi di microscopia elettronica e ottica (UO3 e UO 1).

Dimensione del campione: possiamo aspettarci almeno una prevalenza del 30% di bronchiectasie, il che significa che 120 pazienti saranno inclusi nella seconda fase dello studio (11)

PAZIENTI BPCO CON BRONCHIECTASI:

In questa popolazione studieremo l'effetto di diverse "profilassi" cioè macrolidi e steroidi inalatori. La popolazione sarà seguita per 12 mesi.

La seguente procedura verrà eseguita ogni 3 mesi e ad ogni riacutizzazione:

Valutazione clinica, Condensato del respiro espirato, Prelievo del siero, Raccolta dell'espettorato.

Sui campioni biologici verranno eseguite tutte le tecniche precedentemente descritte più i test di funzionalità renale ed epatica (sicurezza).

Verrà eseguita la coltura dell'espettorato per valutare la flora batterica e i modelli di resistenza.

Disegno dello studio:

120 pazienti saranno randomizzati in 3 gruppi (40 pts) per ricevere:

1. Standard di sicurezza
2. azitromicina 500 mg OD 3 giorni a settimana (lunedì, mercoledì, venerdì) per 6 mesi e poi steroidi per via inalatoria (fluticasone 500 ug bid) per 6 mesi
3. steroidi inalatori (fluticasone 500 ug bid) per 6 mesi e poi azitromicina 500 mg OD 3 giorni a settimana (lunedì, mercoledì, venerdì) per 6 mesi

Punti finali:

PRIMARIO

• effetti dei trattamenti sui parametri dell'infiammazione bronchiale SECONDARIO
• effetti dei trattamenti sulla frequenza delle riacutizzazioni
• effetti dei trattamenti sulla funzione polmonare

Misura di prova:

Possiamo aspettarci una differenza del 40% tra pazienti trattati e non trattati per almeno uno tra TNFa, IL6, IL8 e cisteinil-leucotrieni. In questo caso abbiamo bisogno di 35 pazienti trattati (per ciascun braccio) e 35 pazienti non trattati per un errore alfa di 0,05 e un beta di 0,1.