Intervenção probiótica para modificações do microbioma e melhorias clínicas na síndrome do X frágil

Um dos indicadores iniciais de saúde, que reflete o estilo de vida e as tendências comportamentais de um indivíduo, é o microbioma e a microbiota intestinal humana. A maior parte do desenvolvimento do microbioma no início da vida humana, juntamente com mudanças significativas na sua composição, ocorre nos primeiros 2 a 3 anos de existência. Apesar dos estudos em curso, ainda não foi alcançada uma compreensão abrangente da funcionalidade da microbiota intestinal e o seu impacto potencial em vários aspectos da saúde e da doença continua a ser um enigma científico complexo. Um corpo crescente de pesquisas está se concentrando na intrincada interação entre o microbioma intestinal e o sistema nervoso central (SNC). A via de sinalização bioquímica bidirecional que conecta o trato gastrointestinal e o SNC é chamada de eixo intestino-cérebro. Este conceito foi recentemente expandido para abranger o "eixo microbiota-intestino-cérebro" ou eixo MGB, destacando o envolvimento da microbiota intestinal nas interações bioquímicas entre estes dois sistemas. Desde o momento do nascimento, os produtos químicos libertados pela microbiota intestinal desempenham um papel fundamental na formação do desenvolvimento do cérebro. Qualquer interrupção nesta interação dinâmica aumenta significativamente o potencial para distúrbios do neurodesenvolvimento (NDDs). Além disso, dados emergentes indicam que a colonização microbiana precoce do trato intestinal desempenha um papel na regulação da neurogênese no hipocampo. Além disso, no contexto da mielinização, um estudo realizado na Irlanda ilumina o potencial envolvimento da microbiota do hospedeiro no controlo da mielinização do córtex pré-frontal no gelo. Camundongos livres de germes exibem um número aumentado de axônios hipermielinizados, acompanhados por uma pronunciada regulação positiva de genes associados à mielinização e flexibilidade da mielina. Por último, os metabolitos produzidos pela microbiota intestinal parecem desempenhar um papel na manutenção da integridade da barreira hematoencefálica do hospedeiro e na influência da permeabilidade paracelular. Os insights de estudos em modelos de camundongos fornecem indicações de que metabólitos específicos, como acetato, propionato e butirato de sódio, estão ligados a ajustes na integridade da barreira hematoencefálica. Eles propõem que os probióticos poderiam potencialmente reequilibrar a composição microbiana no intestino humano, desempenhando assim um papel na terapia e prevenção de problemas de saúde mental, como estresse e transtornos de ansiedade. O estudo de Wang et al. sobre os efeitos probióticos-prebióticos em crianças com diagnóstico de transtorno do espectro do autismo (TEA) revelou uma redução nas bactérias patogênicas (Clostridium) e um aumento nas benéficas (como Bifidobacteriales), resultando na diminuição da gravidade do TEA e problemas gastrointestinais. sintomas. Este eixo de comunicação bidirecional, envolvendo várias vias de sinalização, apresenta um vasto domínio para exploração posterior. Intervenções destinadas a modular a microbiota intestinal, como a utilização de antibióticos, probióticos, prebióticos e, potencialmente, transplante de microbiota fecal (FMT), poderiam exercer influência sobre os atributos clínicos e a progressão dos NDDs. Os tipos mais comuns de probióticos incluem a levedura Saccharomyces boulardii, bem como espécies dos grupos Lactobacillus e Bifidobacterium. Em ensaios clínicos, os probióticos mostraram potencial no tratamento de fenótipos comportamentais semelhantes ao TEA e sintomas gastrointestinais, bem como perfis sensoriais em crianças com TEA. Num estudo egípcio realizado de forma aberta, 30 crianças com autismo receberam suplementos probióticos por um período de três meses. Após a suplementação, a análise de amostras de fezes por reação em cadeia da polimerase (PCR) revelou um aumento na população de bactérias benéficas, especificamente Lactobacilos e Bifidobactérias. Além disso, foram observadas melhorias notáveis ​​na gravidade dos sintomas do autismo entre os participantes. Este estudo sugere que a intervenção probiótica pode ser promissora como método complementar para melhorar o bem-estar de indivíduos com TEA. Os efeitos positivos observados no equilíbrio microbiano e na gravidade dos sintomas apontam para um caminho potencial para explorar o papel dos probióticos no aumento das estratégias de tratamento para o autismo. Probióticos e microbioma intestinal na síndrome do X frágil (SXF). O papel do microbioma intestinal na síndrome do X frágil (SXF) permanece amplamente inexplorado. Até onde sabemos, a relação entre FXS em humanos e a microbiota intestinal ainda não foi avaliada. No entanto, os dados obtidos do estudo Fragile X Online Registry with Accessible Database (FORWARD) revelaram que o consumo de fórmula infantil à base de soja está associado ao aumento da prevalência de autismo, problemas gastrointestinais, alergias e comportamentos autistas mais graves relacionados à linguagem e auto-estima. comportamento prejudicial em indivíduos com SXF. Deve-se notar que os problemas gastrointestinais foram o motivo mais frequentemente citado para a mudança para a fórmula infantil à base de soja, com uma taxa de uso relatada de 25% na população do estudo FORWARD, que é significativamente maior do que a população em geral. Um dos possíveis mecanismos subjacentes aos efeitos induzidos pela soja no TEA e na SXF poderia incluir um microbioma intestinal alterado. Além disso, existem várias pesquisas pré-clínicas que enfatizam o papel da disbiose e/ou probióticos em modelos animais de SXF. A microbiota humana e de rato partilham 89% de semelhança nos géneros bacterianos globais, o que significa que o resultado deve ser realista e transferível entre espécies ao modelar doenças humanas em modelos animais. FXS é um exemplo proeminente de desregulação epigenética e constitui a causa monogênica mais prevalente de deficiência intelectual (DI) e transtorno do espectro do autismo (TEA). A síndrome emerge de uma expansão alongada da repetição do trinucleotídeo CGG excedendo 200 repetições, o que leva à inibição transcricional devido à hipermetilação do promotor e da região de repetição dentro da 5'-UTR do gene da ribonucleoproteína 1 mensageira frágil do X (FMR1). A ausência resultante ou expressão diminuída do produto gênico codificado, FMRP, sustenta a manifestação de FXS. O silenciamento epigenético do FMR1, mediado pela metilação do DNA e modificações das histonas que levam à perda de FMRP, estende sua influência por todo o genoma, afetando vários RNAs não codificantes. Consequentemente, esta perturbação impacta a transcrição de múltiplos genes essenciais para a plasticidade sináptica e funções neuronais, contribuindo assim para o fenótipo FXS. O estudo realizado em 2022 comparou os perfis epigenéticos de dois grupos distintos de camundongos: um grupo que foi exposto ao Lactobacillus reuteri durante o desenvolvimento pré-natal e outro grupo que recebeu tratamento com placebo. A investigação centrou-se em 23 genes específicos conhecidos pelo seu envolvimento em funções neurológicas. Notavelmente, uma disparidade substancial e estatisticamente significativa nos padrões de metilação foi identificada entre estes dois grupos. É importante reconhecer que as diferenças observadas na metilação podem ser potencialmente influenciadas por variações genéticas inerentes ao modelo de camundongo. Apesar desta possibilidade, estes resultados ganham credibilidade a partir das disparidades significativas detectadas entre os grupos de controlo e experimental, que incluíam irmãos de ninhada aleatoriamente variados. Consequentemente, os investigadores tenderam a atribuir estas descobertas à influência de uma microbiota intestinal alterada, como sugerido pelos seus resultados.

2. Cronogramas do estudo O estudo planeja inscrever 15 participantes com FXS, com idades entre 3 e 18 anos. ambos os sexos, durante o período de 1 ano e concluir todas as atividades relacionadas ao estudo até janeiro de 2025. Durante o período de estudo de 3 meses, os participantes comparecerão a três visitas ao Hospital Especial para Paralisia Cerebral e Neurologia do Desenvolvimento, Belgrado, triagem/linha de base, visitas de 6 semanas e 3 meses. Além disso, ligações telefônicas de rotina serão feitas uma vez por semana durante o primeiro mês do estudo. Este teste tem um design de site único. Todos os resultados e dados serão anonimizados para proteger a confidencialidade do sujeito da pesquisa.

3.Objetivos Objetivo principal

1. Avaliar a eficácia da mistura probiótica que contém Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, administrada por via oral, uma vez ao dia, durante 12 semanas a crianças com síndrome do X frágil (SXF) de 3 a 18 anos. sobre seu comportamento e processamento cerebral.

   Objetivos secundários

2. Avaliação da ligação entre: (i) modificações do microbioma por mistura probiótica que contém Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, administrada por via oral, uma vez ao dia, durante 12 semanas e (ii) manifestações comportamentais em crianças de 3 a 18 anos com diagnóstico de SXF.

3. Avaliação da ligação entre: (i) modificações do microbioma por mistura probiótica que contém Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, administrada por via oral, uma vez ao dia, durante 12 semanas e ii) processamento cerebral (a. paradigma de habituação potencial relacionado a eventos e monitoramento do olhar social usando o Eye Tracker; b. análise EEG) em crianças de 3 a 18 anos com diagnóstico de SXF.

   Objetivo expiratório 1. Análises da composição do microbioma e avaliação de suas alterações e modificações (por mistura probiótica que contém Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, administrada por via oral, uma vez ao dia, durante 12 semanas) que pode levar à clínica 4. Hipótese: Diariamente a intervenção com mistura probiótica que contém Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve levará a: (i) modificações significativas do microbioma (aumento da diversidade da microbiota intestinal e mudanças na composição da microbiota intestinal na direção de bactérias benéficas) e (ii) consequentemente a alterações clínicas melhora em crianças, de ambos os sexos, com idades entre 3 e 18 anos com diagnóstico de SXF durante um período de tratamento de 3 meses.

4. Hipótese: A intervenção diária com mistura probiótica que contém Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve levará a: (i) modificações significativas do microbioma (aumento da diversidade da microbiota intestinal e mudanças na composição da microbiota intestinal na direção de bactérias benéficas) e (ii) consequentemente, à melhoria clínica em crianças, de ambos os sexos, com idades compreendidas entre os 3 e os 18 anos, diagnosticadas com SXF durante um período de tratamento de 3 meses.
5. Design de estudo. Este é um ensaio aberto sem mascaramento, onde cada participante recebe probiótico por 3 meses (12 semanas). Será uma tarefa de grupo único. Nesta abordagem, os participantes atuam como seus próprios controles, medindo o microbioma e outros parâmetros antes e depois de tomar os probióticos. Este design foi escolhido porque o microbioma individual é altamente personalizado. Mesmo dentro de uma família, os indivíduos podem ter microbiomas distintos. A composição única do microbioma de um indivíduo pode ter implicações na eficácia dos probióticos. Assim, as mudanças nas análises e pontuações entre a linha de base e o período de estudo de 3 meses serão avaliadas para todos. Especificamente, serão examinadas modificações do microbioma que podem estar associadas a mudanças no comportamento e no processamento cerebral. O estudo será aprovado pelo IRB do hospital.

Pacientes (até 15 indivíduos com idade entre 3 e 18 anos, ambos os sexos) serão recrutados e incluídos no estudo na Clínica X Frágil do Hospital Especial para Paralisia Cerebral e Neurologia do Desenvolvimento em Belgrado, Sérvia (mais informações em: https:// frágilx.org/our-research/fragile-x-clinics/international-support-clinics/#serbia). No início do estudo, um histórico médico detalhado e exames físicos e neurológicos serão realizados, com todos os medicamentos e problemas médicos documentados para todos os participantes. Nas primeiras 4 semanas, cada paciente receberá uma ligação semanal para avaliar a tolerabilidade do probiótico e quaisquer eventos adversos (EAs). A visita 2 será organizada após 6 semanas e a visita final 3 após 12 semanas do período de estudo. Qualquer mudança nos medicamentos também será documentada durante as visitas. O exame e a documentação dos EAs serão repetidos em cada visita, enquanto o CGI-I pontuará na visita 2 e na visita final 3. As medidas de resultado serão repetidas na visita de acompanhamento final aos 3 meses/final do tratamento. Amostras de fezes serão coletadas duas vezes, nas visitas inicial e final. As análises do microbioma serão realizadas uma única vez, ao final do estudo, quando todas as amostras forem coletadas e enviadas ao laboratório selecionado. O cronograma completo de todos os procedimentos do estudo também está listado em formato de tabela abaixo. Probióticos selecionados. Todos os participantes receberão uma mistura probiótica que contém: (i) Lactobacillus casei BL 2401 (40%), (ii) Lactobacillus salivarius BL 2201 (40%) (iii) Bifidobacterium breve BL 3406 (20%). A quantidade total é de 5 x109 UFC em uma cápsula de HPMC, no final do prazo de validade. Estas cepas estão registradas e preservadas na Coleção Nacional Francesa de Culturas de Microorganismos (CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes). Estão na lista QPS (Qualificado e Presunção de Segurança) da EFSA e são considerados seguros para utilização em alimentos e produtos dietéticos. Graças às suas propriedades, esta mistura de cepas para uso humano atuará como auxiliar na terapia de distúrbios digestivos, cutâneos, respiratórios e do neurodesenvolvimento, com o objetivo de equilibrar a resposta imunológica e restaurar a microbiota intestinal e a barreira intestinal. Através do mapeamento genético, as cepas foram identificadas de acordo com critérios fenotípicos (morfologia, testes bioquímicos, condições em que crescem), mas também de acordo com critérios genotípicos (sequenciação de 16S rDNA). Em estudos in vitro para cada uma das três estirpes específicas, foram examinados e determinados os seguintes: (i) resistência a condições no tracto digestivo; (ii) adesão às células da mucosa intestinal; (iii) capacidade de sobrevivência e estabilidade a longo prazo; (iv) ausência de transferência genética para resistência a antibióticos; (v) a capacidade de estimular a secreção de IL-10 e (vi) antagonismo e inibição do crescimento de bactérias patogênicas.

5. Gerenciamento e confidencialidade de dados e amostras Os participantes serão recrutados por meio da Clínica X Frágil do Hospital Especial para Paralisia Cerebral e Neurologia do Desenvolvimento, Belgrado, Sérvia. Sujeitos potenciais interessados ​​em participar do estudo serão pré-selecionados por telefone ou no local pela equipe de pesquisa. Isto também permitirá que potenciais sujeitos façam perguntas relacionadas ao estudo e discutam o estudo em profundidade com a equipe de pesquisa. A revisão dos registros médicos dos sujeitos é para informações limitadas e apenas para determinar a elegibilidade. Os dados são derivados de procedimentos clinicamente indicados e há risco mínimo para o sujeito. Somente o pessoal de pesquisa terá acesso aos registros médicos. Sem uma revisão inicial do prontuário médico para fins de triagem, não seria possível identificar potenciais sujeitos e confirmar sua aplicabilidade para participação no estudo. Assim que a elegibilidade for confirmada, os sujeitos serão abordados para obter autorização para acessar e usar suas informações de saúde para a pesquisa. Os registros do estudo de cada participante serão arquivados em um prontuário de pesquisa e as informações do sujeito serão codificadas para proteger a confidencialidade. Todos os gráficos serão mantidos em um armário trancado ou em uma sala de arquivo trancada. Os identificadores utilizados para identificar os sujeitos serão mantidos em escritórios trancados e/ou armários trancados, e o banco de dados eletrônico contendo informações pessoais será mantido em uma rede de computadores segura, acessível apenas à equipe de pesquisa do PI. Utilizaremos o sistema REDCap (Research Electronic Data Capture) para gerenciamento de dados. R. O sistema REDCap consiste em aplicativos seguros baseados na web que são flexíveis o suficiente para serem usados ​​em uma variedade de tipos de pesquisa, fornecem uma interface intuitiva para os usuários inserirem dados e possuem regras de validação em tempo real (com tipo de dados automatizado e verificações de intervalo ) no momento da entrada. Esses sistemas oferecem fácil manipulação de dados com trilhas de auditoria para relatórios, monitoramento e consulta de registros de pacientes, bem como mecanismo de exportação automatizado para pacotes estatísticos comuns (SPSS, SAS, Stata, R/S-Plus). As informações de saúde dos sujeitos, juntamente com os identificadores, serão mantidas com o investigador, até a conclusão do estudo, ou quando o acesso imediato não for mais necessário. Depois disso, as informações podem ser transferidas para registros para armazenamento a longo prazo. Quando o investigador ou qualquer agência reguladora não exigir mais as informações (mas não antes de 5 anos), os documentos serão destruídos com segurança. Todo o pessoal do estudo terá acesso aos registros, dados e amostras do estudo. Se necessário, o acesso aos registros e dados do estudo será disponibilizado aos representantes do IRB. Os sujeitos inscritos serão informados de que o pessoal do estudo e os representantes do IRB terão acesso aos seus registros. Isso será incluído no formulário de consentimento e também será revisado minuciosamente durante o processo de consentimento. Todo o pessoal de pesquisa terá treinamento atualizado em GCP para investigadores e funcionários envolvidos em pesquisas envolvendo seres humanos. Além disso, serão feitas todas as tentativas para garantir que as informações pessoais e médicas do sujeito serão mantidas em sigilo; no entanto, não podemos garantir total privacidade. As informações pessoais e médicas do sujeito podem ser fornecidas se exigido por lei. Por exemplo, reportar informações confidenciais (como abuso infantil) às autoridades locais, se necessário. Os resultados e dados são desidentificados para proteger a confidencialidade do paciente. A análise da eficácia do tratamento será baseada nas mudanças nas análises e pontuações entre o início do estudo e o período de estudo de 3 meses. O endpoint escolhido em 3 meses, com base em dados preliminares, fornece um período de tempo de tratamento razoável para avaliar mudanças na resposta e/ou correlação entre as medidas de linha de base e de acompanhamento. O Conselho de Monitoramento e Segurança de Dados (DSMB) não é necessário para tais pesquisas onde os efeitos do probiótico serão examinados. Registros bancários de dados e/ou amostras e documentos relativos à condução deste estudo, incluindo Formulários de Consentimento Livre e Esclarecido, resultados de testes laboratoriais e registros de inventário de medicamentos, devem ser retidos pelo Investigador Principal por pelo menos 5 anos após a conclusão ou término do estudo, ou pelo período de tempo exigido pelas autoridades de saúde nacionais ou locais relevantes, o que for mais longo. Após esse período, os documentos poderão ser destruídos, observada a regulamentação local. Os registros transferidos para outra parte serão desidentificados. Banco de amostras de fezes: Todas as amostras coletadas para análises de microbioma serão desidentificadas e conterão apenas o número de identificação do estudo do sujeito e a data/hora da coleta. As amostras biológicas serão processadas, armazenadas e destruídas de acordo com os protocolos em vigor para amostras biológicas.

Retirada dos sujeitos Todos os sujeitos e seus pais/responsáveis ​​legais autorizados serão informados de que são livres para desistir da participação neste estudo a qualquer momento, por qualquer motivo e sem prejuízo. Todas as tentativas razoáveis ​​devem ser feitas pelo investigador para manter os sujeitos no estudo; no entanto, os sujeitos devem ser retirados do estudo se retirarem o consentimento para participar. O investigador deve tentar entrar em contato com os indivíduos que não compareceram às visitas agendadas por telefone ou outros meios para excluir a possibilidade de um EA ser a causa da retirada. Caso esta seja a causa, o EA deve ser documentado, notificado e acompanhado. O investigador também tem o direito de retirar os sujeitos do estudo a qualquer momento por falta de efeito terapêutico que seja intolerável ou de outra forma inaceitável para o sujeito, por EAs intoleráveis ​​ou inaceitáveis, doenças intercorrentes, não cumprimento dos procedimentos do estudo, razões administrativas, ou na opinião do investigador, para proteger o melhor interesse do sujeito. Se um sujeito for retirado antes de completar o estudo, o motivo da retirada e a data da descontinuação serão registrados no formulário de relato de caso apropriado. As informações coletadas sobre um sujeito que encerrou o estudo precocemente, bem como quaisquer amostras de sangue e fezes, serão mantidas para análise, a menos que os cuidadores do sujeito solicitem especificamente que essas informações sejam removidas da análise. Os cuidadores serão informados disso como parte do processo de consentimento e também lembrados disso no caso de rescisão antecipada.

Riscos para os participantes Os riscos previstos mais comuns devido à participação no estudo incluem ansiedade, frustração, fadiga ou constrangimento durante o preenchimento de questionários, avaliações e testes do estudo, bem como durante o histórico médico e exames. Serão oferecidas pausas aos sujeitos conforme necessário. Os riscos associados à coleta de sangue incluem hematomas, dor e leve risco de infecção no local de entrada da agulha para a coleta de sangue. Este local será cuidadosamente limpo antes do sorteio e um curativo apropriado será aplicado na área. Os probióticos podem causar problemas estomacais leves, especialmente nos primeiros dias quando a criança começa a tomá-los. As crianças podem ter dores de estômago, gases, diarreia. Esses sintomas geralmente desaparecem depois que o corpo se acostuma com eles.

Chamadas telefônicas semanais durante o primeiro mês serão feitas pela equipe do estudo para avaliar a presença de efeitos colaterais. .

Benefícios potenciais para os indivíduos Os benefícios potenciais da participação no estudo são que os indivíduos com SXF: 1. podem experimentar uma melhora na saúde física, nos sintomas comportamentais e/ou nas habilidades cognitivas como resultado do tratamento com probióticos; 2. serão submetidos a avaliações neuropsicológicas, cujos resultados poderão ser disponibilizados aos familiares dos participantes mediante solicitação; 3. receberá exames médicos oferecidos por meio do estudo. Além disso, um hemograma completo será realizado como parte deste estudo. Os participantes serão informados sobre os achados clinicamente significativos do exame médico ou do hemograma completo, conforme apropriado4. receberá análises de microbioma oferecidas por meio do estudo. Os participantes serão informados sobre achados clinicamente significativos. 5. compreenderão que estão contribuindo para o conhecimento científico que pode levar à expansão das opções de tratamento direcionadas para indivíduos com SXF.

Nenhum outro benefício da participação está previsto.