Intervento probiotico per modifiche del microbioma e miglioramenti clinici nella sindrome dell'X fragile

Uno degli indicatori iniziali di salute, che riflette lo stile di vita e le tendenze comportamentali di un individuo, è il microbioma e il microbiota intestinale umano. La maggior parte dello sviluppo del microbioma nei primi anni di vita umana, insieme a cambiamenti significativi nella sua composizione, avvengono entro i primi 2 o 3 anni di esistenza. Nonostante gli studi in corso, non è ancora stata raggiunta una comprensione completa della funzionalità del microbiota intestinale e il suo potenziale impatto su vari aspetti della salute e delle malattie rimane un complesso enigma scientifico. Un numero crescente di ricerche si sta concentrando sulla complessa interazione tra il microbioma intestinale e il sistema nervoso centrale (SNC). La via di segnalazione biochimica bidirezionale che collega il tratto gastrointestinale e il sistema nervoso centrale è denominata asse intestino-cervello. Questo concetto è stato recentemente ampliato per comprendere l’”asse microbiota-intestino-cervello” o asse MGB, evidenziando il coinvolgimento del microbiota intestinale nelle interazioni biochimiche tra questi due sistemi. Dal momento della nascita, le sostanze chimiche rilasciate dal microbiota intestinale svolgono un ruolo fondamentale nel modellare lo sviluppo del cervello. Qualsiasi interruzione in questa interazione dinamica aumenta significativamente il potenziale di disturbi dello sviluppo neurologico (NDD). Inoltre, i dati emergenti indicano che la colonizzazione microbica precoce del tratto intestinale svolge un ruolo nella regolazione della neurogenesi nell’ippocampo. Inoltre, nel contesto della mielinizzazione, uno studio irlandese mette in luce il potenziale coinvolgimento del microbiota dell’ospite nel controllo della mielinizzazione della corteccia prefrontale nel ghiaccio. I topi privi di germi mostrano un numero maggiore di assoni ipermielinizzati, accompagnato da una pronunciata sovraregolazione dei geni associati alla mielinizzazione e alla flessibilità della mielina. Infine, i metaboliti prodotti dal microbiota intestinale sembrano svolgere un ruolo nel mantenimento dell’integrità della barriera emato-encefalica dell’ospite e nell’influenzare la permeabilità paracellulare. Approfondimenti provenienti da studi su modelli murini forniscono indicazioni che metaboliti specifici, come acetato, propionato e butirrato di sodio, sono collegati ad aggiustamenti nell’integrità della barriera ematoencefalica. Propongono che i probiotici potrebbero potenzialmente riequilibrare la composizione microbica nell’intestino umano, svolgendo così un ruolo nella terapia e nella prevenzione di problemi di salute mentale come stress e disturbi d’ansia. Lo studio di Wang et al. sugli effetti probiotici-prebiotici nei bambini con diagnosi di disturbo dello spettro autistico (ASD) ha rivelato una riduzione dei batteri patogeni (Clostridium) e un aumento di quelli benefici (come i Bifidobacteriales), con conseguente diminuzione della gravità dell'ASD e dei disturbi gastrointestinali. sintomi. Questo asse di comunicazione bidirezionale, che coinvolge vari percorsi di segnalazione, presenta un vasto ambito per ulteriori esplorazioni. Gli interventi volti a modulare il microbiota intestinale, come l’utilizzo di antibiotici, probiotici, prebiotici e potenzialmente il trapianto di microbiota fecale (FMT), potrebbero potenzialmente esercitare un’influenza sugli attributi clinici e sulla progressione delle NDD. I tipi più comuni di probiotici includono il lievito Saccharomyces boulardii, nonché le specie dei gruppi Lactobacillus e Bifidobacterium. Negli studi clinici, i probiotici hanno mostrato un potenziale nel trattamento dei fenotipi comportamentali simili all’ASD e dei sintomi gastrointestinali, nonché dei profili sensoriali nei bambini con ASD. In uno studio egiziano condotto in aperto, a 30 bambini con autismo sono stati somministrati integratori probiotici per un periodo di tre mesi. Dopo l'integrazione, l'analisi dei campioni di feci mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) ha rivelato un aumento della popolazione di batteri benefici, in particolare lattobacilli e bifidobatteri. Inoltre, sono stati osservati notevoli miglioramenti nella gravità dei sintomi dell’autismo tra i partecipanti. Questo studio suggerisce che l’intervento probiotico potrebbe essere promettente come metodo complementare per migliorare il benessere degli individui con ASD. Gli effetti positivi osservati sull’equilibrio microbico e sulla gravità dei sintomi indicano una potenziale strada per esplorare il ruolo dei probiotici nell’aumentare le strategie di trattamento per l’autismo. Probiotici e microbioma intestinale nella sindrome dell’X fragile (FXS). Il ruolo del microbioma intestinale nella sindrome dell’X fragile (FXS) rimane in gran parte inesplorato. A nostra conoscenza, la relazione tra FXS nell’uomo e il microbiota intestinale non è stata ancora valutata. Tuttavia, i dati ottenuti dallo studio Fragile X Online Registry with Accessible Database (FORWARD) hanno rivelato che il consumo di latte artificiale a base di soia è associato ad una maggiore prevalenza di autismo, problemi gastrointestinali, allergie e comportamenti autistici più gravi legati al linguaggio e all’auto-apprendimento. comportamento dannoso negli individui con FXS. Va notato che i problemi gastrointestinali sono stati la ragione più frequente citata per il passaggio al latte artificiale a base di soia, con un tasso di utilizzo riportato del 25% nella popolazione dello studio FORWARD, che è significativamente più alto rispetto alla popolazione generale. Uno dei possibili meccanismi alla base degli effetti indotti dalla soia nell’ASD e nella FXS potrebbe includere un microbioma intestinale alterato. Inoltre, esistono diverse ricerche precliniche che enfatizzano il ruolo della disbiosi e/o dei probiotici nei modelli animali FXS. Il microbiota del topo e quello umano condividono l’89% di somiglianza nei generi batterici complessivi, il che significa che il risultato dovrebbe essere realistico e trasferibile tra le specie quando si modellano le malattie umane in modelli animali. L'FXS è un importante esempio di disregolazione epigenetica e costituisce la causa monogenica più diffusa di disabilità intellettiva (ID) e disturbo dello spettro autistico (ASD). La sindrome emerge da un'espansione allungata della ripetizione del trinucleotide CGG superiore a 200 ripetizioni, che porta all'inibizione trascrizionale dovuta all'ipermetilazione del promotore e della regione ripetuta all'interno del 5'-UTR del gene della ribonucleoproteina 1 messaggera X fragile (FMR1). La risultante assenza o ridotta espressione del prodotto genetico codificato, FMRP, è alla base della manifestazione di FXS. Il silenziamento epigenetico di FMR1, mediato dalla metilazione del DNA e dalle modifiche degli istoni che portano alla perdita di FMRP, estende la sua influenza attraverso il genoma, influenzando vari RNA non codificanti. Di conseguenza, questa interruzione influisce sulla trascrizione di più geni fondamentali per la plasticità sinaptica e le funzioni neuronali, contribuendo così al fenotipo FXS. Lo studio condotto nel 2022 ha confrontato i profili epigenetici di due distinti gruppi di topi: un gruppo che è stato esposto al Lactobacillus reuteri durante lo sviluppo prenatale e un altro gruppo che ha ricevuto un trattamento con placebo. L'indagine si è concentrata su 23 geni specifici noti per il loro coinvolgimento nelle funzioni neurologiche. In particolare, tra questi due gruppi è stata identificata una disparità sostanziale e statisticamente significativa nei modelli di metilazione. È importante riconoscere che le differenze osservate nella metilazione potrebbero essere potenzialmente influenzate da variazioni genetiche inerenti al modello murino. Nonostante questa possibilità, questi risultati guadagnano credibilità dalle significative disparità rilevate tra il gruppo di controllo e quello sperimentale, che includevano compagni di cucciolata assortiti casualmente. Di conseguenza, i ricercatori erano propensi ad attribuire questi risultati all’influenza di un microbiota intestinale alterato, come suggerito dai loro risultati.

2. Tempistiche dello studio Lo studio prevede di arruolare 15 partecipanti con FXS, di età compresa tra 3 e 18 anni. entrambi i sessi, durante il periodo di 1 anno e completare tutte le attività legate allo studio entro gennaio 2025. Durante il periodo di studio di 3 mesi, i soggetti parteciperanno a tre visite all'Ospedale speciale per la paralisi cerebrale e la neurologia dello sviluppo, Belgrado, visite di screening/basale, 6 settimane e 3 mesi. Inoltre, durante il primo mese di studio verranno effettuate telefonate di routine una volta alla settimana. Questo studio ha un design a sito singolo. Tutti i risultati e i dati saranno deidentificati per proteggere la riservatezza del soggetto della ricerca.

3.Obiettivi Obiettivo primario

1. Valutare l'efficacia della miscela probiotica contenente Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, somministrata per via orale, una volta al giorno, per 12 settimane a bambini con sindrome dell'X fragile (FXS) di età compresa tra 3 e 18 anni. sul loro comportamento e sull’elaborazione del cervello.

   Obiettivi secondari

2. Valutazione del legame tra: (i) modifiche del microbioma mediante miscela probiotica che contiene Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, somministrata per via orale, una volta al giorno, per 12 settimane e (ii) manifestazioni comportamentali nei bambini di età compresa tra 3 e 18 anni con diagnosi di FXS.

3. Valutazione del legame tra: (i) modifiche del microbioma mediante miscela probiotica contenente Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, somministrata per via orale, una volta al giorno, per 12 settimane e ii) elaborazione cerebrale (a. paradigma di potenziale assuefazione correlato agli eventi e monitoraggio dello sguardo sociale utilizzando l'Eye Tracker; B. Analisi EEG) nei bambini di età compresa tra 3 e 18 anni con diagnosi di FXS.

   Obiettivo espiratorio 1. Analisi della composizione del microbioma e valutazione delle sue alterazioni e modificazioni (mediante miscela probiotica contenente Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve, somministrata per via orale, una volta al giorno, per 12 settimane) che possono portare a risultati clinici 4. Ipotesi: Giornaliera l'intervento con una miscela probiotica contenente Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve porterà a: (i) modifiche significative del microbioma (maggiore diversità del microbiota intestinale e cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale in direzione dei batteri benefici) e (ii) conseguentemente a risultati clinici miglioramento nei bambini, di entrambi i sessi, di età compresa tra 3 e 18 anni con diagnosi di FXS durante un periodo di trattamento di 3 mesi.

4. Ipotesi: l’intervento quotidiano con una miscela probiotica contenente Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius e Bifidobacterium breve porterà a: (i) modifiche significative del microbioma (maggiore diversità del microbiota intestinale e cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale in direzione dei batteri benefici) e (ii) di conseguenza al miglioramento clinico nei bambini, di entrambi i sessi, di età compresa tra 3 e 18 anni con diagnosi di FXS durante un periodo di trattamento di 3 mesi.
5. Progettazione dello studio. Si tratta di uno studio in aperto senza mascheramento, in cui ciascun partecipante riceve un probiotico per 3 mesi (12 settimane). Sarà un'assegnazione a gruppo singolo. In questo approccio, i partecipanti agiscono come controlli misurando il microbioma e altri parametri prima e dopo l’assunzione dei probiotici. Questo design è stato scelto perché il microbioma individuale è altamente personalizzato. Anche all’interno di una famiglia, gli individui possono avere microbiomi distinti. La composizione unica del microbioma di un individuo può avere implicazioni sull’efficacia dei probiotici. Pertanto, verranno valutati per tutti i cambiamenti nelle analisi e nei punteggi tra il basale e il periodo di studio di 3 mesi. Nello specifico, verranno esaminate le modifiche del microbioma che potrebbero essere associate a cambiamenti nel comportamento e nell'elaborazione del cervello. Lo studio sarà approvato dall'IRB dell'ospedale.

I pazienti (fino a 15 individui di età compresa tra 3 e 18 anni, entrambi i sessi) saranno reclutati e inclusi nello studio all'interno della Fragile X Clinic presso l'Ospedale Speciale per la Paralisi Cerebrale e la Neurologia dello Sviluppo a Belgrado, Serbia (maggiori informazioni su: https:// fragilix.org/our-research/fragile-x-clinics/international-support-clinics/#serbia). Al basale, verranno effettuati un'anamnesi medica dettagliata e un esame fisico e neurologico, con tutti i farmaci e i problemi medici documentati per tutti i partecipanti. Nelle prime 4 settimane, ciascun paziente riceverà una chiamata settimanale per valutare la tollerabilità del probiotico e gli eventuali eventi avversi (AE). La visita 2 sarà organizzata dopo 6 settimane e la visita finale 3 dopo 12 settimane di periodo di studio. Eventuali variazioni dei farmaci verranno documentate anche durante le visite. L'esame e la documentazione degli eventi avversi verranno ripetuti ad ogni visita, mentre CGI-I assegnerà il punteggio alla visita 2 e alla visita finale 3. Le misure dei risultati verranno ripetute alla visita di follow-up finale a 3 mesi/fine del trattamento. I campioni di feci verranno raccolti due volte, alla visita basale e finale. Le analisi del microbioma verranno eseguite una volta, alla fine dello studio, quando tutti i campioni saranno raccolti e inviati al laboratorio selezionato. Il programma completo di tutte le procedure dello studio è elencato anche in formato tabella di seguito. Probiotici selezionati. Tutti i partecipanti riceveranno una miscela probiotica che contiene: (i) Lactobacillus casei BL 2401 (40%), (ii) Lactobacillus salivarius BL 2201 (40%) (iii) Bifidobacterium breve BL 3406 (20%). La quantità totale è di 5 x109 CFU in una capsula HPMC, alla fine del periodo di validità. Questi ceppi sono registrati e conservati nella Collezione nazionale francese di colture di microrganismi (CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes). Sono presenti nell'elenco QPS (Qualificato e Presunzione di Sicurezza) dell'EFSA e sono considerati sicuri per l'uso negli alimenti e nei prodotti dietetici. Grazie alle sue proprietà, questa miscela di ceppi per uso umano fungerà da coadiuvante nella terapia dei disturbi digestivi, cutanei, respiratori e dello sviluppo neurologico, con l'obiettivo di bilanciare la risposta immunitaria e ripristinare il microbiota intestinale e la barriera intestinale. Attraverso la mappatura genetica, i ceppi sono stati identificati secondo criteri fenotipici (morfologia, test biochimici, condizioni in cui crescono) ma anche secondo criteri genotipici (sequenziamento del rDNA 16S). Negli studi in vitro per ciascuno dei tre ceppi specifici, sono stati esaminati e determinati: (i) resistenza alle condizioni del tratto digestivo; (ii) adesione alle cellule della mucosa intestinale; (iii) sopravvivenza e stabilità a lungo termine; (iv) assenza di trasferimento genico per la resistenza agli antibiotici; (v) la capacità di stimolare la secrezione di IL-10 e (vi) antagonismo e inibizione della crescita di batteri patogeni.

5. Gestione dei dati e dei campioni e riservatezza I soggetti verranno reclutati tramite la Clinica dell'X Fragile presso l'Ospedale Speciale per la Paralisi Cerebrale e la Neurologia dello Sviluppo, Belgrado, Serbia. I potenziali soggetti interessati a partecipare allo studio verranno preselezionati tramite telefono o sul posto dal gruppo di ricerca. Ciò consentirà inoltre ai potenziali soggetti di porre domande relative allo studio e di discutere lo studio in modo approfondito con il gruppo di ricerca. La revisione delle cartelle cliniche dei soggetti serve per informazioni limitate e solo per determinare l'idoneità. I dati derivano da procedure clinicamente indicate e il rischio per il soggetto è minimo. Solo il personale di ricerca avrà accesso alle cartelle cliniche. Senza una revisione iniziale della cartella clinica a fini di screening, non sarebbe possibile identificare potenziali soggetti e confermarne l’applicabilità per la partecipazione allo studio. Una volta confermata l'idoneità, i soggetti verranno contattati per ottenere l'autorizzazione ad accedere e utilizzare le proprie informazioni sanitarie per la ricerca. I record di studio di ciascun partecipante verranno archiviati in una tabella di ricerca e le informazioni sui soggetti saranno codificate per proteggerne la riservatezza. Tutti i grafici saranno conservati in un armadietto chiuso a chiave o in un archivio chiuso a chiave. Gli identificatori utilizzati per identificare i soggetti saranno conservati in uffici e/o armadi chiusi a chiave, e il database elettronico contenente informazioni personali sarà conservato su una rete informatica sicura accessibile solo al gruppo di ricerca di PI. Utilizzeremo il sistema REDCap (Research Electronic Data Capture) per la gestione dei dati. R. Il sistema REDCap è costituito da applicazioni sicure basate sul Web che sono sufficientemente flessibili da poter essere utilizzate per una varietà di tipi di ricerca, forniscono un'interfaccia intuitiva per consentire agli utenti di inserire dati e dispongono di regole di convalida in tempo reale (con tipi di dati automatizzati e controlli dell'intervallo ) al momento dell'iscrizione. Questi sistemi offrono una facile manipolazione dei dati con audit trail per la reportistica, il monitoraggio e l'interrogazione delle cartelle cliniche dei pazienti, nonché un meccanismo di esportazione automatizzata verso pacchetti statistici comuni (SPSS, SAS, Stata, R/S-Plus). Le informazioni sanitarie dei soggetti, insieme agli identificatori, saranno conservate presso lo sperimentatore fino alla conclusione dello studio o quando l'accesso immediato non sarà più richiesto. Successivamente, le informazioni possono essere trasferite nei registri per l'archiviazione a lungo termine. Quando l'investigatore o qualsiasi agenzia di regolamentazione non avrà più bisogno delle informazioni (ma non prima di 5 anni), i documenti verranno distrutti in modo sicuro. Tutto il personale dello studio avrà accesso ai registri, ai dati e ai campioni dello studio. Se necessario, l'accesso ai registri e ai dati degli studi sarà reso disponibile ai rappresentanti dell'IRB. I soggetti iscritti verranno informati che il personale dello studio e i rappresentanti dell'IRB avranno accesso ai loro registri. Questo sarà incluso nel modulo di consenso e sarà anche esaminato attentamente durante il processo di consenso. Tutto il personale di ricerca avrà una formazione aggiornata sulle GCP per gli investigatori e il personale coinvolto nella ricerca su soggetti umani. Inoltre, verrà fatto ogni sforzo per garantire che le informazioni personali e mediche del soggetto siano mantenute private; tuttavia, non possiamo garantire la privacy totale. I dati personali e medici del soggetto potranno essere divulgati se richiesto dalla legge. Ad esempio, segnalando informazioni sensibili (come abusi sui minori) alle autorità locali, se necessario. I risultati e i dati vengono resi anonimi per proteggere la riservatezza del paziente. L'analisi dell'efficacia del trattamento si baserà sui cambiamenti nelle analisi e nei punteggi tra il basale e il periodo di studio di 3 mesi. L'endpoint scelto a 3 mesi, sulla base di dati preliminari, fornisce un periodo di trattamento ragionevole per valutare i cambiamenti nella risposta e/o la correlazione tra le misure di base e quelle di follow-up. Il Data Safety and Monitoring Board (DSMB) non è necessario per tali ricerche in cui verranno esaminati gli effetti dei probiotici. Dati e/o registrazioni e documenti relativi all'archiviazione dei campioni relativi alla conduzione di questo studio, compresi i moduli di consenso informato, i risultati dei test di laboratorio e i registri dell'inventario dei farmaci, devono essere conservati dal ricercatore principale per almeno 5 anni dopo il completamento o la conclusione dello studio, o per il periodo di tempo richiesto dalle autorità sanitarie nazionali o locali competenti, a seconda di quale sia il periodo più lungo. Trascorso tale periodo, i documenti potranno essere distrutti, salvo quanto previsto dalle normative locali. I documenti trasferiti a un'altra parte verranno resi anonimi. Conservazione dei campioni di feci: tutti i campioni raccolti per le analisi del microbioma saranno deidentificati e conterranno solo il numero ID dello studio del soggetto e la data/ora della raccolta. I campioni biologici saranno trattati, conservati e distrutti in conformità con i protocolli in vigore per i campioni biologici.

Ritiro dei soggetti Tutti i soggetti e i loro genitori/tutori legali autorizzati verranno informati che sono liberi di ritirarsi dalla partecipazione a questo studio in qualsiasi momento, per qualsiasi motivo e senza pregiudizio. Lo sperimentatore dovrebbe fare ogni ragionevole tentativo per mantenere i soggetti nello studio; tuttavia, i soggetti devono essere ritirati dallo studio se ritirano il consenso a partecipare. L'investigatore deve tentare di contattare i soggetti che non si presentano alle visite programmate per telefono o con altri mezzi per escludere la possibilità che un AE sia la causa del ritiro. Se questa fosse la causa, l'AE deve essere documentato, segnalato e seguito. Lo sperimentatore ha inoltre il diritto di ritirare i soggetti dallo studio in qualsiasi momento per mancanza di effetto terapeutico intollerabile o altrimenti inaccettabile per il soggetto, per eventi avversi intollerabili o inaccettabili, malattie intercorrenti, non conformità con le procedure dello studio, motivi amministrativi o secondo l'opinione dell'investigatore, per proteggere il miglior interesse del soggetto. Se un soggetto viene ritirato prima del completamento dello studio, il motivo del ritiro e la data di interruzione verranno registrati sull'apposito modulo di segnalazione del caso. Le informazioni raccolte su un soggetto che ha interrotto anticipatamente lo studio, nonché eventuali campioni di sangue e feci, verranno conservati per l'analisi a meno che gli operatori sanitari del soggetto non chiedano specificamente che tali informazioni vengano rimosse dall'analisi. Gli operatori sanitari ne verranno informati nell'ambito del processo di consenso e verranno ricordati anche in caso di risoluzione anticipata.

Rischi per i soggetti I rischi previsti più comuni dovuti alla partecipazione allo studio includono ansia, frustrazione, affaticamento o imbarazzo durante la risposta ai questionari, le valutazioni e i test dello studio, nonché durante l'anamnesi e l'esame. Le pause saranno offerte ai soggetti secondo necessità. I rischi associati ai prelievi di sangue comprendono lividi, dolore e un leggero rischio di infezione nel sito di ingresso dell'ago per il prelievo di sangue. Questo sito verrà accuratamente pulito prima del sorteggio e sull'area verrà applicata una medicazione adeguata. I probiotici potrebbero causare lievi problemi di stomaco, soprattutto nei primi giorni in cui il bambino inizia ad assumerli. I bambini potrebbero avere disturbi di stomaco, gas, diarrea. Questi sintomi di solito scompaiono dopo che il corpo si è abituato.

Durante il primo mese verranno effettuate telefonate settimanali da parte del personale dello studio per valutare la presenza di effetti collaterali. .

Potenziali benefici per i soggetti I potenziali benefici della partecipazione allo studio sono che i soggetti con FXS: 1. possono sperimentare un miglioramento della salute fisica, dei sintomi comportamentali e/o delle capacità cognitive come risultato del trattamento con probiotici; 2. sarà sottoposto a valutazioni neuropsicologiche i cui risultati potranno essere messi a disposizione dei familiari dei partecipanti su richiesta; 3. riceveranno gli esami medici offerti attraverso lo studio. Inoltre, come parte di questo studio verrà condotto un emocromo completo. I partecipanti verranno informati dei risultati clinicamente significativi derivanti dall'esame medico o dall'emocromo, a seconda dei casi4. riceveranno le analisi del microbioma offerte attraverso lo studio. I partecipanti saranno informati dei risultati clinicamente significativi. 5. capiranno che stanno contribuendo alla conoscenza scientifica che potrebbe portare all'espansione delle opzioni terapeutiche mirate per i soggetti affetti da FXS.

Non sono previsti altri benefici derivanti dalla partecipazione.