Пробиотическое вмешательство для модификации микробиома и клинических улучшений при синдроме ломкой Х-хромосомы

Одним из исходных показателей здоровья, отражающих образ жизни и поведенческие тенденции человека, является микробиом и микробиота кишечника человека. Большая часть развития микробиома на ранних этапах жизни человека, наряду со значительными изменениями в его составе, происходит в течение первых 2–3 лет существования. Несмотря на продолжающиеся исследования, всестороннее понимание функциональности кишечной микробиоты еще не достигнуто, а ее потенциальное влияние на различные аспекты здоровья и болезней остается сложной научной загадкой. Все больше исследований сосредотачивается на сложном взаимодействии между микробиомом кишечника и центральной нервной системой (ЦНС). Двунаправленный биохимический сигнальный путь, соединяющий желудочно-кишечный тракт и ЦНС, называется осью кишечник-мозг. Эта концепция недавно была расширена и теперь охватывает «ось микробиота-кишечник-мозг» или ось MGB, подчеркивая участие микробиоты кишечника в биохимических взаимодействиях между этими двумя системами. С момента рождения химические вещества, выделяемые микробиотой кишечника, играют ключевую роль в формировании развития мозга. Любое нарушение этого динамического взаимодействия значительно повышает вероятность нарушений нервного развития (НДР). Кроме того, новые данные показывают, что ранняя микробная колонизация кишечного тракта играет роль в регуляции нейрогенеза в гиппокампе. Более того, в контексте миелинизации исследование, проведенное в Ирландии, проливает свет на потенциальное участие микробиоты хозяина в контроле миелинизации префронтальной коры во льду. У мышей, свободных от микробов, наблюдается повышенное количество гипермиелинизированных аксонов, что сопровождается выраженной активацией генов, связанных с миелинизацией и гибкостью миелина. Наконец, метаболиты, продуцируемые микробиотой кишечника, по-видимому, играют роль в поддержании целостности гематоэнцефалического барьера хозяина и влиянии на парацеллюлярную проницаемость. Результаты исследований на моделях мышей указывают на то, что определенные метаболиты, такие как ацетат, пропионат и бутират натрия, связаны с изменением целостности гематоэнцефалического барьера. Они предполагают, что пробиотики потенциально могут сбалансировать микробный состав в кишечнике человека, тем самым играя роль в терапии и профилактике проблем психического здоровья, таких как стресс и тревожные расстройства. Исследование Wang и соавторов пробиотических и пребиотических эффектов у детей с диагнозом расстройства аутистического спектра (РАС) выявило снижение количества патогенных бактерий (Clostridium) и увеличение количества полезных (таких как Bifidobacteriales), что привело к снижению тяжести РАС и желудочно-кишечных расстройств. симптомы. Эта двунаправленная ось связи, включающая различные сигнальные пути, представляет собой обширную область для дальнейшего исследования. Вмешательства, направленные на модуляцию микробиоты кишечника, такие как использование антибиотиков, пробиотиков, пребиотиков и, возможно, трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ), потенциально могут оказывать влияние на клинические признаки и прогрессирование НДР. К наиболее распространенным типам пробиотиков относятся дрожжи Saccharomyces boulardii, а также виды из групп Lactobacillus и Bifidobacterium. В клинических испытаниях пробиотики показали потенциал в лечении РАС-подобных поведенческих фенотипов и симптомов желудочно-кишечного тракта, а также сенсорных профилей у детей с РАС. В египетском исследовании, проведенном открытым способом, 30 детям с аутизмом давали пробиотические добавки в течение трех месяцев. После приема добавки анализ образцов стула с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) выявил увеличение популяции полезных бактерий, в частности лактобацилл и бифидобактерий. Более того, среди участников наблюдалось заметное улучшение выраженности симптомов аутизма. Это исследование предполагает, что пробиотическое вмешательство может оказаться многообещающим в качестве дополнительного метода улучшения благополучия людей с РАС. Наблюдаемое положительное влияние на микробный баланс и тяжесть симптомов указывает на потенциальный путь изучения роли пробиотиков в усилении стратегии лечения аутизма. Пробиотики и кишечный микробиом при синдроме ломкой Х-хромосомы (FXS). Роль кишечного микробиома при синдроме ломкой Х-хромосомы (FXS) остается в значительной степени неизученной. Насколько нам известно, связь между FXS у людей и кишечной микробиотой еще не изучена. Однако данные, полученные в ходе исследования Fragile X Online Registry with Accessible Database (FORWARD), показали, что потребление детских смесей на основе сои связано с увеличением распространенности аутизма, проблем с желудочно-кишечным трактом, аллергией и более тяжелым аутистическим поведением, связанным с речью и самообслуживанием. вредное поведение у людей с FXS. Следует отметить, что проблемы с желудочно-кишечным трактом были наиболее частой причиной перехода на детскую смесь на основе сои, при этом уровень использования составил 25% в исследовании FORWARD, что значительно выше, чем в общей популяции. Один из возможных механизмов, лежащих в основе эффектов, вызванных соей при РАС и FXS, может включать изменение микробиома кишечника. Кроме того, есть несколько доклинических исследований, которые подчеркивают роль дисбиоза и/или пробиотиков в моделях животных FXS. Микробиота мыши и человека имеет 89% сходства в общих бактериальных родах, что означает, что результат должен быть реалистичным и переносимым между видами при моделировании заболеваний человека на животных моделях. FXS является ярким примером эпигенетической дисрегуляции и представляет собой наиболее распространенную моногенную причину умственной отсталости (ID) и расстройств аутистического спектра (РАС). Синдром возникает в результате увеличения удлиненного тринуклеотидного повтора CGG, превышающего 200 повторов, что приводит к ингибированию транскрипции из-за гиперметилирования промотора и области повтора в 5'-UTR хрупкого гена X-мессенджерного рибонуклеопротеина 1 (FMR1). Результирующее отсутствие или пониженная экспрессия кодируемого генного продукта FMRP лежит в основе проявления FXS. Эпигенетическое молчание FMR1, опосредованное метилированием ДНК и модификациями гистонов, которые приводят к потере FMRP, распространяет свое влияние на весь геном, затрагивая различные некодирующие РНК. Следовательно, это нарушение влияет на транскрипцию множества генов, имеющих решающее значение для синаптической пластичности и функций нейронов, тем самым способствуя фенотипу FXS. В исследовании, проведенном в 2022 году, сравнивались эпигенетические профили двух разных групп мышей: одна группа, которая подвергалась воздействию Lactobacillus reuteri во время внутриутробного развития, и другая группа, которая получала лечение плацебо. Исследование было сосредоточено на 23 конкретных генах, известных своим участием в неврологических функциях. Примечательно, что между этими двумя группами было выявлено существенное и статистически значимое различие в характере метилирования. Важно признать, что на наблюдаемые различия в метилировании потенциально могут влиять генетические вариации, присущие мышиной модели. Несмотря на такую ​​возможность, эти результаты приобретают достоверность благодаря значительным различиям, обнаруженным между контрольной и экспериментальной группами, в которые входили случайно отобранные однопометники. Следовательно, исследователи были склонны приписать эти результаты влиянию измененной микробиоты кишечника, о чем свидетельствуют их результаты.

2. Сроки исследования. В исследование планируется включить 15 участников с FXS в возрасте от 3 до 18 лет. обоих полов в течение 1 года и завершить все мероприятия, связанные с обучением, к январю 2025 года. В течение 3-месячного периода исследования субъекты посетят три визита в Специальную больницу церебрального паралича и неврологии развития в Белграде, скрининг/базовый визит, 6-недельный и 3-месячный визит. Кроме того, в течение первого месяца исследования будут совершаться обычные телефонные звонки один раз в неделю. Это испытание имеет одноцентровый дизайн. Все результаты и данные будут обезличены для защиты конфиденциальности субъекта исследования.

3.Цели Основная цель

1. Оценить эффективность пробиотической смеси, содержащей Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius и Bifidobacterium breve, назначаемой перорально один раз в день в течение 12 недель детям с синдромом ломкой Х-хромосомы (FXS) в возрасте от 3 до 18 лет. на их поведение и работу мозга.

   Второстепенные цели

2. Оценка связи между: (i) модификациями микробиома пробиотической смесью, содержащей Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius и Bifidobacterium breve, принимаемой перорально один раз в день в течение 12 недель, и (ii) поведенческими проявлениями у детей в возрасте от 3 до 18 лет с диагнозом FXS.

3. Оценка связи между: (i) модификациями микробиома пробиотической смесью, которая содержит Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius и Bifidobacterium breve, принимаемой перорально один раз в день в течение 12 недель, и ii) обработкой мозга (a. парадигма потенциального привыкания, связанная с событиями, и мониторинг социального взгляда с использованием Eye Tracker; б. ЭЭГ-анализ) у детей в возрасте от 3 до 18 лет с диагнозом ФКС.

   Цель выдоха 1. Анализ состава микробиома и оценка его изменений и модификаций (с помощью пробиотической смеси, содержащей Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius и Bifidobacterium breve, принимаемой перорально один раз в день в течение 12 недель), которые могут привести к клинике 4. Гипотеза: Ежедневно Вмешательство пробиотической смесью, содержащей Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius и Bifidobacterium breve, приведет к: (i) значительным модификациям микробиома (увеличению разнообразия кишечной микробиоты и изменениям в составе кишечной микробиоты в сторону полезных бактерий) и (ii), как следствие, к клиническим улучшение у детей обоих полов в возрасте от 3 до 18 лет с диагнозом FXS в течение 3-месячного периода лечения.

4. Гипотеза: Ежедневное применение смеси пробиотиков, содержащей Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius и Bifidobacterium breve, приведет к: (i) значительным модификациям микробиома (увеличению разнообразия кишечной микробиоты и изменениям в составе кишечной микробиоты в сторону полезных бактерий) и (ii) как следствие, к клиническому улучшению у детей обоих полов в возрасте от 3 до 18 лет с диагнозом FXS в течение 3-месячного периода лечения.
5. Дизайн исследования. Это открытое исследование без маскировки, в котором каждый участник получает пробиотик в течение 3 месяцев (12 недель). Это будет одногрупповое задание. В этом подходе участники действуют как собственный контроль, измеряя микробиом и другие параметры до и после приема пробиотиков. Этот дизайн был выбран потому, что микробиом человека очень персонализирован. Даже внутри семьи у людей могут быть разные микробиомы. Уникальный состав микробиома человека может иметь значение для эффективности пробиотиков. Таким образом, изменения в анализах и баллах между исходным уровнем и трехмесячным периодом исследования будут оцениваться для каждого. В частности, будут изучены модификации микробиома, которые могут быть связаны с изменениями в поведении и работе мозга. Исследование будет одобрено IRB больницы.

Пациенты (до 15 человек в возрасте от 3 до 18 лет, обоего пола) будут набраны и включены в исследование в клинике Fragile X в Специальной больнице для церебрального паралича и неврологии развития в Белграде, Сербия (более подробная информация: https:// хрупкийx.org/our-research/fragile-x-clinics/international-support-clinics/#serbia). На исходном уровне будет проведен подробный медицинский анамнез, а также физическое и неврологическое обследование с документированием всех лекарств и медицинских проблем для всех участников. В течение первых 4 недель каждому пациенту будут еженедельно звонить для оценки переносимости пробиотика и любых нежелательных явлений (НЯ). Второй визит будет организован через 6 недель, а последний визит 3 — через 12 недель периода обучения. Любые изменения в лекарствах также будут документироваться во время посещений. Обследование и документирование НЯ будут повторяться при каждом посещении, тогда как баллы CGI-I будут оцениваться при посещении 2 и заключительном посещении 3. Измерения результатов будут повторяться во время последнего контрольного визита через 3 месяца/окончание лечения. Образцы стула будут собираться дважды: во время исходного и заключительного визитов. Анализы микробиома будут проводиться один раз, в конце исследования, когда все образцы будут собраны и отправлены в выбранную лабораторию. Полный график всех процедур исследования также указан в виде таблицы ниже. Отборные пробиотики. Все участники получат пробиотическую смесь, которая содержит: (i) Lactobacillus casei BL 2401 (40%), (ii) Lactobacillus salivarius BL 2201 (40%) (iii) Bifidobacterium breve BL 3406 (20%). Общее количество составляет 5 x109 КОЕ в одной капсуле ГПМЦ в конце срока годности. Эти штаммы зарегистрированы и сохранены во Французской национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes). Они включены в список QPS (Квалифицированная безопасность и презумпция безопасности) EFSA и считаются безопасными для использования в пищевых и диетических продуктах. Благодаря своим свойствам эта смесь штаммов для использования человеком будет способствовать терапии расстройств пищеварения, кожи, дыхания и нервно-психического развития с целью балансировки иммунного ответа и восстановления кишечной микробиоты и кишечного барьера. С помощью генетического картирования штаммы были идентифицированы по фенотипическим критериям (морфология, биохимические исследования, условия, в которых они растут), а также по генотипическим критериям (секвенирование 16S рДНК). В исследованиях in vitro для каждого из трех конкретных штаммов исследовали и определили: (i) устойчивость к условиям пищеварительного тракта; (ii) адгезия к клеткам слизистой оболочки кишечника; (iii) живучесть и долгосрочная стабильность; (iv) отсутствие переноса генов устойчивости к антибиотикам; (v) способность стимулировать секрецию IL-10 и (vi) антагонизм и ингибирование роста патогенных бактерий.

5. Управление данными и образцами, а также конфиденциальность. Субъекты будут набраны через клинику Fragile X при Специальной больнице для церебрального паралича и неврологии развития, Белград, Сербия. Потенциальные субъекты, заинтересованные в участии в исследовании, будут предварительно проверены исследовательской группой либо по телефону, либо на месте. Это также позволит потенциальным участникам задавать вопросы, связанные с исследованием, и подробно обсуждать исследование с исследовательской группой. Анализ медицинских записей субъектов предназначен для получения ограниченной информации и только для определения соответствия критериям участия. Данные получены в результате клинически показанных процедур, и риск для субъекта минимален. Доступ к медицинским записям будет иметь только исследовательский персонал. Без первоначального анализа медицинской документации в целях скрининга было бы невозможно идентифицировать потенциальных субъектов и подтвердить их пригодность для участия в исследовании. Как только право на участие будет подтверждено, субъектам будет предложено получить разрешение на доступ и использование их медицинской информации для исследования. Записи об исследовании каждого участника будут внесены в карту исследования, а информация об субъекте будет закодирована для защиты конфиденциальности. Все диаграммы будут храниться в запертом шкафу или в запертой картотеке. Идентификаторы, используемые для идентификации субъектов, будут храниться в запертых кабинетах и/или запертых шкафах, а электронная база данных, содержащая личную информацию, будет храниться в защищенной компьютерной сети, доступной только для исследовательской группы PI. Для управления данными мы будем использовать систему REDCap (Research Electronic Data Capture). р. Система REDCap состоит из безопасных веб-приложений, которые достаточно гибки, чтобы их можно было использовать для различных типов исследований, предоставляют пользователям интуитивно понятный интерфейс для ввода данных и имеют правила проверки в реальном времени (с автоматическими проверками типов данных и диапазонов). ) на момент входа. Эти системы предлагают легкое манипулирование данными с помощью контрольных журналов для отчетности, мониторинга и запроса записей пациентов, а также автоматизированный механизм экспорта в распространенные статистические пакеты (SPSS, SAS, Stata, R/S-Plus). Информация о здоровье субъектов вместе с идентификаторами будет храниться у исследователя до завершения исследования или до тех пор, пока немедленный доступ больше не потребуется. После этого информация может быть перенесена в записи для долгосрочного хранения. Когда следователь или контролирующие органы перестанут нуждаться в информации (но не ранее, чем через 5 лет), документы будут надежно уничтожены. Весь исследовательский персонал будет иметь доступ к записям исследования, данным и образцам. При необходимости доступ к записям и данным исследования будет предоставлен представителям IRB. Зарегистрированные субъекты будут проинформированы о том, что исследовательский персонал и представители IRB будут иметь доступ к их записям. Это будет включено в форму согласия, а также будет тщательно проверено в процессе получения согласия. Весь исследовательский персонал пройдет текущую подготовку GCP для исследователей и сотрудников, участвующих в исследованиях с участием людей. Кроме того, будут предприняты все усилия для обеспечения конфиденциальности личной и медицинской информации субъекта; однако мы не можем гарантировать полную конфиденциальность. Личная и медицинская информация субъекта может быть раскрыта, если этого требует закон. Например, при необходимости сообщайте местным властям конфиденциальную информацию (например, о жестоком обращении с детьми). Результаты и данные обезличиваются для защиты конфиденциальности пациентов. Анализ эффективности лечения будет основан на изменениях в анализах и баллах между исходным уровнем и 3-месячным периодом исследования. Выбранная конечная точка через 3 месяца, основанная на предварительных данных, обеспечивает разумный период времени лечения для оценки изменений в ответе и/или корреляции между исходными и последующими показателями. Совет по безопасности и мониторингу данных (DSMB) не требуется для таких исследований, где будут изучены эффекты пробиотиков. Данные и/или банковские записи образцов и документы, относящиеся к проведению этого исследования, включая формы информированного согласия, результаты лабораторных исследований и записи о запасах лекарств, должны храниться главным исследователем в течение как минимум 5 лет после завершения или прекращения исследования. или на период времени, требуемый соответствующими национальными или местными органами здравоохранения, в зависимости от того, какой срок дольше. По истечении этого периода документы могут быть уничтожены в соответствии с местным законодательством. Записи, переданные другой стороне, будут обезличены. Банкование образцов стула: Все собранные образцы для анализа микробиома будут обезличены и будут содержать только идентификационный номер исследования субъекта и дату/время сбора. Биологические образцы будут обрабатываться, храниться и уничтожаться в соответствии с действующими протоколами для биологических образцов.

Отказ субъектов Всем субъектам и их родителям/законным опекунам будет сообщено, что они могут отказаться от участия в этом исследовании в любое время, по любой причине и без ущерба. Исследователь должен предпринять все разумные попытки удержать субъектов в исследовании; однако субъекты должны быть исключены из исследования, если они отзовут согласие на участие. Исследователь должен попытаться связаться с субъектами, которые не посещают запланированные посещения, по телефону или другими способами, чтобы исключить возможность того, что НЯ является причиной отказа. Если это является причиной, НЯ необходимо задокументировать, сообщить и принять меры. Исследователь также имеет право исключить субъектов из исследования в любое время из-за отсутствия терапевтического эффекта, который является непереносимым или иным образом неприемлемым для субъекта, из-за непереносимых или неприемлемых НЯ, интеркуррентного заболевания, несоблюдения процедур исследования, административных причин или по мнению следователя, для защиты интересов субъекта. Если субъект исключен из исследования до завершения исследования, причина исключения и дата прекращения участия будут записаны в соответствующей форме отчета о случае. Информация, собранная о субъекте, который досрочно завершил исследование, а также любые образцы крови и стула, будут храниться для анализа, если только лица, осуществляющие уход за субъектом, специально не попросят удалить эту информацию из анализа. Лица, осуществляющие уход, будут проинформированы об этом в рамках процесса получения согласия, а также напомнены об этом в случае досрочного расторжения.

Риски для субъектов. Наиболее распространенные ожидаемые риски, связанные с участием в исследовании, включают тревогу, разочарование, усталость или смущение во время ответов на анкеты, оценки исследования и тестирования, а также во время сбора анамнеза и обследования. Перерывы будут предлагаться испытуемым по мере необходимости. Риски, связанные с забором крови, включают синяки, болезненность и небольшой риск заражения в месте ввода иглы для взятия крови. Перед жеребьевкой это место будет тщательно очищено и на него будет наложена соответствующая повязка. Пробиотики могут вызвать легкие проблемы с желудком, особенно в первые несколько дней, когда ребенок начинает их принимать. У детей может быть расстройство желудка, газы, диарея. Эти симптомы обычно проходят после того, как организм к ним привыкнет.

В течение первого месяца сотрудники исследования будут совершать еженедельные телефонные звонки для оценки наличия побочных эффектов. .

Потенциальные преимущества для субъектов Потенциальные преимущества участия в исследовании заключаются в том, что субъекты с FXS: 1. могут испытывать улучшение физического здоровья, поведенческих симптомов и/или когнитивных способностей в результате лечения пробиотиком; 2. пройдут нейропсихологическое обследование, результаты которого могут быть предоставлены семьям участников по запросу; 3. пройдут медицинские осмотры, предлагаемые в рамках исследования. Кроме того, в рамках этого исследования будет проведен общий анализ крови. Участники будут проинформированы о клинически значимых результатах медицинского осмотра или клинического анализа крови, в зависимости от обстоятельств4. получат анализы микробиома, предложенные в ходе исследования. Участники будут проинформированы о клинически значимых результатах. 5. поймут, что они вносят вклад в научные знания, которые могут привести к расширению вариантов целевого лечения для субъектов с FXS.

Никаких других преимуществ от участия не предвидится.