益生菌干预对脆性 X 综合征的微生物组修饰和临床改善

反映个人生活方式和行为倾向的最初健康指标之一是人类肠道微生物组和微生物群。 人类早期生命中大部分微生物组的发育及其组成的显着变化都发生在出生后的最初 2 至 3 年内。 尽管研究正在进行，但对肠道微生物群功能的全面理解尚未实现，其对健康和疾病各个方面的潜在影响仍然是一个复杂的科学难题。 越来越多的研究关注肠道微生物组与中枢神经系统 (CNS) 之间复杂的相互作用。 连接胃肠道和中枢神经系统的双向生化信号通路被称为肠-脑轴。 这一概念最近已扩展到涵盖“微生物群-肠-脑轴”或 MGB 轴，强调肠道微生物群参与这两个系统之间的生化相互作用。 从出生那一刻起，肠道微生物群释放的化学物质在塑造大脑发育方面发挥着关键作用。 这种动态相互作用的任何破坏都会显着增加神经发育障碍（NDD）的可能性。 此外，新出现的数据表明，肠道的早期微生物定植在调节海马神经发生中发挥着作用。 此外，在髓鞘形成的背景下，爱尔兰的一项研究阐明了宿主微生物群在控制冰中前额皮质髓鞘形成中的潜在参与。 无菌小鼠表现出髓鞘过多的轴突数量增加，伴随着与髓鞘形成和髓鞘灵活性相关的基因的显着上调。 最后，肠道微生物群产生的代谢物似乎在维持宿主血脑屏障的完整性和影响细胞旁通透性方面发挥着作用。 对小鼠模型的研究表明，特定代谢物（例如乙酸盐、丙酸盐和丁酸钠）与血脑屏障完整性的调整有关。 他们提出，益生菌有可能重新平衡人体肠道中的微生物组成，从而在治疗和预防压力和焦虑症等心理健康问题中发挥作用。 Wang 等人对益生菌-益生元对诊断患有自闭症谱系障碍 (ASD) 的儿童的影响进行的研究表明，致病菌（梭状芽胞杆菌）减少，有益菌（如双歧杆菌）增加，从而导致 ASD 严重程度和胃肠道​​症状减轻。症状。 这种涉及各种信号通路的双向通信轴为进一步探索提供了广阔的领域。 旨在调节肠道微生物群的干预措施，例如使用抗生素、益生菌、益生元和潜在的粪便微生物群移植 (FMT)，可能会对 NDD 的临床特征和进展产生影响。 最常见的益生菌类型包括布拉氏酵母菌，以及乳杆菌和双歧杆菌属的物种。 在临床试验中，益生菌显示出治疗自闭症谱系障碍儿童的类似行为表型和胃肠道症状以及感觉特征的潜力。 在埃及一项以开放标签方式进行的研究中，30 名自闭症儿童接受了为期三个月的益生菌补充剂。 补充后，使用聚合酶链反应 (PCR) 对粪便样本进行分析显示，有益细菌数量有所增加，特别是乳酸菌和双歧杆菌。 此外，参与者的自闭症症状的严重程度也得到了显着的改善。 这项研究表明，益生菌干预有望成为增强自闭症谱系障碍患者福祉的补充方法。 观察到的对微生物平衡和症状严重程度的积极影响为探索益生菌在增强自闭症治疗策略中的作用提供了潜在途径。 脆性 X 综合征 (FXS) 中的益生菌和肠道微生物组。 肠道微生物组在脆性 X 综合征 (FXS) 中的作用在很大程度上仍未被探索。 据我们所知，人类 FXS 与肠道微生物群之间的关系尚未得到评估。 然而，从易碎 X 在线注册数据库（FORWARD）研究获得的数据显示，食用大豆婴儿配方奶粉与自闭症、胃肠道问题、过敏以及与语言和自我相关的更严重自闭症行为的患病率增加有关。 FXS 患者的伤害性行为。 值得注意的是，胃肠道问题是改用大豆婴儿配方奶粉的最常见原因，据报道，在 FORWARD 研究人群中，使用率为 25%，显着高于一般人群。 大豆对 ASD 和 FXS 产生影响的可能机制之一可能包括肠道微生物组的改变。 此外，还有几项临床前研究强调了 FXS 动物模型中生态失调和/或益生菌的作用。 小鼠和人类微生物群在整个细菌属中具有 89% 的相似性，这意味着在动物模型中模拟人类疾病时，结果应该是现实的并且可以在物种之间转移。 FXS 是表观遗传失调的一个突出例子，是智力障碍 (ID) 和自闭症谱系障碍 (ASD) 最常见的单基因原因。 该综合征是由超过 200 个重复的延长 CGG 三核苷酸重复扩展引起的，由于脆弱的 X 信使核糖核蛋白 1 (FMR1) 基因的启动子和 5'-UTR 内的重复区域过度甲基化，导致转录抑制。 由此产生的编码基因产物 FMRP 表达缺失或减少，是 FXS 表现的基础。 FMR1 的表观遗传沉默由 DNA 甲基化和组蛋白修饰介导，导致 FMRP 丢失，将其影响扩展到整个基因组，影响各种非编码 RNA。 因此，这种破坏会影响对突触可塑性和神经元功能至关重要的多个基因的转录，从而导致 FXS 表型。 这项研究于 2022 年进行，比较了两组不同小鼠的表观遗传特征：一组在产前发育期间接触罗伊氏乳杆菌，另一组接受安慰剂治疗。 该研究重点关注 23 个因参与神经功能而闻名的特定基因。 值得注意的是，这两组之间的甲基化模式存在显着且具有统计学意义的差异。 重要的是要承认观察到的甲基化差异可能受到小鼠模型固有的遗传变异的影响。 尽管存在这种可能性，但这些发现从对照组和实验组之间发现的显着差异中获得了可信度，其中包括随机分类的同窝同伴。 因此，研究人员倾向于将这些发现归因于肠道微生物群改变的影响，正如他们的结果所表明的那样。

2. 研究时间表 该研究计划招募 15 名 FXS 参与者，年龄为 3-18 岁。男女皆宜，在 1 年内完成所有与研究相关的活动，并于 2025 年 1 月之前完成。 在为期 3 个月的研究期间，受试者将参加贝尔格莱德脑瘫和发育神经科特殊医院的 3 次就诊、筛查/基线、6 周和 3 个月的就诊。 此外，在研究的第一个月，每周都会进行一次例行电话通话。 该试验采用单中心设计。 所有结果和数据都将被去识别化，以保护研究对象的机密。

3.目标 主要目标

1. 旨在评估含有干酪乳杆菌、唾液乳杆菌和短双歧杆菌的益生菌混合物对 3-18 岁患有脆性 X 综合征 (FXS) 的儿童每日一次口服，持续 12 周的功效。他们的行为和大脑处理。

   次要目标

2. 评估以下两者之间的联系：(i) 含有干酪乳杆菌、唾液乳杆菌和短双歧杆菌的益生菌混合物对微生物组的改变，每天口服一次，持续 12 周；(ii) 诊断为 FXS 的 3 至 18 岁儿童的行为表现。

3. 评估以下之间的联系：(i) 含有干酪乳杆菌、唾液乳杆菌和短双歧杆菌的益生菌混合物对微生物组的改变，每天口服一次，持续 12 周；ii) 大脑处理（a. 使用眼动仪进行事件相关的潜在习惯范式和社交凝视监测； b. 脑电图分析）适用于 3 至 18 岁诊断为 FXS 的儿童。

   期末目标 1. 分析微生物组组成并评估其变化和修饰（通过含有干酪乳杆菌、唾液乳杆菌和短双歧杆菌的益生菌混合物，口服给药，每天一次，持续 12 周），这可能导致临床 4。假设：每天使用含有干酪乳杆菌、唾液乳杆菌和短双歧杆菌的益生菌混合物进行干预将导致：（i）显着的微生物组改变（肠道微生物群的多样性增加以及肠道微生物群组成向有益细菌的方向变化）和（ii）从而导致临床效果3 至 18 岁诊断患有 FXS 的儿童（男女）在 3 个月的治疗期间得到改善。

4. 假设：每日使用含有干酪乳杆菌、唾液乳杆菌和短双歧杆菌的益生菌混合物进行干预将导致：(i) 显着的微生物组改变（肠道微生物群的多样性增加以及肠道微生物群组成向有益细菌的方向变化）和 (ii)因此，在 3 个月的治疗期间，诊断患有 FXS 的 3 至 18 岁儿童（男女）的临床改善。
5. 学习规划。 这是无掩蔽的开放标签试验，每位参与者接受益生菌 3 个月（12 周）。 这将是单组作业。 在这种方法中，参与者通过测量服用益生菌前后的微生物组和其他参数来充当自己的对照。 选择这种设计是因为个人的微生物组是高度个性化的。 即使在一个家庭内，个体也可能拥有不同的微生物组。 个体微生物组的独特组成可能会对益生菌的有效性产生影响。 因此，将为每个人评估基线和 3 个月研究期之间的分析和分数变化。 具体来说，将检查可能与行为和大脑处理变化相关的微生物组修饰。 该研究将得到医院 IRB 的批准。

患者（最多 15 名 3-18 岁的个体，男女）将被招募并纳入塞尔维亚贝尔格莱德脑瘫和发育神经科特殊医院 Fragile X Clinic 的研究中（更多信息请访问：https:// fragilex.org/our-research/fragile-x-clinics/international-support-clinics/#serbia）。 在基线时，将进行详细的病史以及身体和神经学检查，并记录所有参与者的所有药物和医疗问题。 在前 4 周内，每位患者每周都会接到一次电话，以评估益生菌的耐受性和任何不良事件 (AE)。 第 2 次访视将在 6 周后组织，最后一次访视 3 将在 12 周研究期后组织。 就诊期间药物的任何变化也将被记录下来。 每次访视时都会重复 AE 的检查和记录，而 CGI-I 将在第 2 次访视和最终访视 3 时进行评分。结果测量将在 3 个月/治疗结束时的最后一次随访时重复。 粪便样本将在基线和最终访视时收集两次。 微生物组分析将在研究结束时进行一次，此时收集所有样本并将其发送到选定的实验室。 所有研究程序的完整时间表也以下表格式列出。 精选益生菌。 所有参与者将收到益生菌混合物，其中含有：(i) 干酪乳杆菌 BL 2401 (40%)，(ii) 唾液乳杆菌 BL 2201 (40%) (iii) 短双歧杆菌 BL 3406 (20%)。 在保质期结束时，一粒 HPMC 胶囊中的总量为 5 x109 CFU。 这些菌株在法国国家微生物菌种保藏中心（CNCM，Collection Nationale de Cultures de Microorganismes）中注册并保存。 它们列于 EFSA 的 QPS（合格和安全推定）列表中，被认为可安全用于食品和膳食产品。 由于其特性，这种供人类使用的菌株混合物将有助于治疗消化、皮肤、呼吸和神经发育障碍，目的是平衡免疫反应并恢复肠道微生物群和肠道屏障。 通过遗传图谱，根据表型标准（形态学、生化测试、生长条件）以及基因型标准（16S rDNA 测序）来鉴定菌株。 在对三种特定菌株的体外研究中，检查并确定了以下内容：（i）对消化道条件的抵抗力； (ii) 与肠粘膜细胞的粘附； (iii) 生存能力和长期稳定性； (iv) 缺乏抗生素抗性基因转移； (v)刺激IL-10分泌的能力和(vi)拮抗和抑制病原菌生长的能力。

5. 数据和样本管理及保密 受试者将通过塞尔维亚贝尔格莱德脑瘫和发育神经病学特殊医院的 Fragile X 诊所招募。 研究团队将通过电话或现场对有兴趣参与研究的潜在受试者进行预筛选。 这也将允许潜在的受试者提出与研究相关的问题并与研究团队深入讨论研究。 对受试者医疗记录的审查仅供有限的信息使用，并且仅用于确定资格。 数据来自临床指示的程序，对受试者的风险最小。 只有研究人员才能访问医疗记录。 如果没有出于筛选目的对病历进行初步审查，就不可能识别潜在的受试者并确认他们是否适用于参与研究。 一旦确认资格，将联系受试者以获得其访问和使用其健康信息进行研究的授权。每个参与者的研究记录将归档在研究图表中，并且受试者信息将被编码以保护机密。 所有图表将保存在上锁的柜子或上锁的文件室中。 用于识别受试者的标识符将保存在上锁的办公室和/或上锁的柜子中，包含个人信息的电子数据库将保存在只有 PI 研究团队可以访问的安全计算机网络上。 我们将使用 REDCap（研究电子数据采集）系统进行数据管理。 河 REDCap 系统由安全的、基于 Web 的应用程序组成，这些应用程序足够灵活，可用于各种类型的研究，为用户输入数据提供直观的界面，并具有实时验证规则（具有自动数据类型和范围检查） ）在输入时。 这些系统提供简单的数据操作，以及用于报告、监控和查询患者记录的审计跟踪，以及常见统计软件包（SPSS、SAS、Stata、R/S-Plus）的自动导出机制。 受试者的健康信息以及标识符将由研究者保存，直到研究结束或不再需要立即访问时。 此后，信息可以转移到记录中以供长期存储。 当研究者或任何监管机构不再需要该信息时（但不超过 5 年），这些文件将被安全粉碎。 所有研究人员都可以访问研究记录、数据和样本。 如果需要，IRB 的代表将可以访问研究记录和数据。 登记的受试者将知道研究人员和 IRB 代表将有权访问他们的记录。 这将包含在同意书中，并将在同意过程中进行彻底审查。 所有研究人员都将接受针对参与人类受试者研究的研究人员和工作人员的最新 GCP 培训。 此外，将尽一切努力确保受试者的个人和医疗信息保密；但是，我们不能保证完全隐私。 如果法律要求，可以透露受试者的个人和医疗信息。 例如，如有必要，向地方当局报告敏感信息（例如虐待儿童）。 结果和数据被去识别化以保护患者的机密。 治疗效果的分析将基于基线和 3 个月研究期之间的分析和评分变化。 根据初步数据，选择的 3 个月终点提供了一个合理的治疗时间段，以评估反应变化和/或基线与后续措施之间的相关性。数据安全和监测委员会 (DSMB) 对于此类研究来说不是必需的，其中将检查益生菌的作用。 与本研究进行有关的数据和/或样本银行记录和文件，包括知情同意书、实验室测试结果和药物库存记录，必须由首席研究员在研究完成或终止后保留至少 5 年，或相关国家或地方卫生当局要求的时间长度，以较长者为准。 在此期限之后，根据当地法规，这些文件可能会被销毁。 转移给另一方的记录将被去识别化。 粪便样本存储：所有收集的用于微生物组分析的样本都将被去识别化，并且仅包含受试者的研究 ID 号和收集日期/时间。 生物样本将按照现有的生物样本协议进行处理、储存和销毁。

受试者退出 所有受试者及其父母/合法授权监护人均会被告知，他们可以随时以任何理由退出本研究，且不会造成任何偏见。 研究者应尽一切合理努力让受试者留在研究中；然而，如果受试者撤回参与研究的同意，则必须退出研究。 研究者必须尝试通过电话或其他方式联系未能参加预定访视的受试者，以排除 AE 导致退出的可能性。 如果这是原因，则必须记录、报告并跟踪 AE。 研究者还有权因受试者无法耐受或无法接受的缺乏治疗效果、无法耐受或不可接受的 AE、并发疾病、不遵守研究程序、管理原因或其他原因随时从研究中退出受试者。研究者认为，为了保护受试者的最大利益。 如果受试者在完成研究之前退出，则退出原因和中止日期将记录在适当的病例报告表上。 收集的有关提前终止研究的受试者的信息以及任何血液和粪便样本将被保留用于分析，除非受试者的护理人员特别要求从分析中删除这些信息。 作为同意过程的一部分，护理人员将被告知这一点，并且在提前终止的情况下也会被提醒。

受试者面临的风险 由于参与研究而导致的最常见的预期风险包括在回答问卷、研究评估和测试以及病史和检查期间的焦虑、沮丧、疲劳或尴尬。 将根据需要为受试者提供休息时间。 与抽血相关的风险包括瘀伤、疼痛以及抽血针入口处轻微感染的风险。 在抽签前将仔细清洁该部位，并在该区域涂上适当的敷料。 益生菌可能会导致轻微的胃部问题，尤其是孩子开始服用益生菌的头几天。 儿童可能会出现胃部不适、胀气、腹泻。 这些症状通常在身体适应后就会消失。

第一个月期间，研究人员每周都会打电话来评估是否存在副作用。 。

对受试者的潜在好处 参与研究的潜在好处是患有 FXS 的受试者： 1. 由于益生菌治疗，身体健康、行为症状和/或认知能力可能得到改善； 2. 将接受神经心理学评估，可根据要求向参与者家属提供评估结果； 3. 将接受通过研究提供的体检。 此外，作为本研究的一部分，将进行全血细胞计数。 参与者将酌情获悉体检或 CBC 中具有临床意义的发现4。 将收到通过该研究提供的微生物组分析。 参与者将被告知具有临床意义的发现。 5. 将理解他们正在为科学知识做出贡献，这可能会导致 FXS 受试者的针对性治疗选择的扩大。

预计参与不会带来其他好处。