Probiotická intervence pro modifikace mikrobiomu a klinická zlepšení u syndromu křehkého X

Jedním z počátečních ukazatelů zdraví, odrážejících životní styl jedince a tendence v chování, je lidský střevní mikrobiom a mikrobiota. Většina vývoje mikrobiomu v raném lidském životě spolu s významnými posuny v jeho složení nastává během prvních 2 až 3 let existence. Navzdory probíhající studii je ještě třeba dosáhnout úplného pochopení funkčnosti střevní mikroflóry a její potenciální dopad na různé aspekty zdraví a nemoci zůstává složitou vědeckou hádankou. Stále větší množství výzkumů se zaměřuje na složitou souhru mezi střevním mikrobiomem a centrálním nervovým systémem (CNS). Obousměrná biochemická signální dráha spojující gastrointestinální trakt a CNS se označuje jako osa střevo-mozek. Tento koncept byl nedávno rozšířen tak, aby zahrnoval "osu mikrobiota-střevo-mozek" nebo osu MGB, což zdůrazňuje zapojení střevní mikroflóry do biochemických interakcí mezi těmito dvěma systémy. Od okamžiku narození hrají chemické látky uvolňované střevní mikroflórou klíčovou roli při formování vývoje mozku. Jakékoli narušení této dynamické interakce významně zvyšuje potenciál pro neurovývojové poruchy (NDD). Kromě toho nové údaje naznačují, že časná mikrobiální kolonizace střevního traktu hraje roli v regulaci neurogeneze v hipokampu. V souvislosti s myelinizací navíc studie z Irska osvětluje potenciální zapojení mikrobioty hostitele do kontroly myelinizace prefrontální kůry v ledu. Bezmikrobní myši vykazují zvýšený počet hypermyelinizovaných axonů, doprovázený výraznou upregulací genů spojených s myelinizací a flexibilitou myelinu. Konečně se zdá, že metabolity produkované střevní mikroflórou hrají roli při udržování integrity hematoencefalické bariéry hostitele a ovlivňují paracelulární permeabilitu. Poznatky ze studií na myších modelech ukazují, že specifické metabolity, jako je acetát, propionát a butyrát sodný, jsou spojeny s úpravami integrity hematoencefalické bariéry. Navrhují, že probiotika by mohla potenciálně vyvážit mikrobiální složení v lidském střevě, a tak hrát roli v terapii a prevenci problémů duševního zdraví, jako je stres a úzkostné poruchy. Studie probioticko-prebiotických účinků u dětí s diagnostikovanou poruchou autistického spektra (ASD) Wang et al. odhalila snížení patogenních bakterií (Clostridium) a zvýšení prospěšných bakterií (jako jsou Bifidobacteriales), což má za následek snížení závažnosti ASD a gastrointestinálního příznaky. Tato obousměrná komunikační osa, zahrnující různé signální cesty, představuje rozsáhlou oblast pro další zkoumání. Intervence zaměřené na modulaci střevní mikroflóry, jako je používání antibiotik, probiotik, prebiotik a případně transplantace fekální mikrobioty (FMT), by mohly potenciálně ovlivnit klinické atributy a progresi NDD. Mezi nejčastější typy probiotik patří kvasinky Saccharomyces boulardii, dále druhy ze skupiny Lactobacillus a Bifidobacterium. V klinických studiích probiotika prokázala potenciál při léčbě behaviorálních fenotypů podobných ASD a GI symptomů a také senzorických profilů u dětí s ASD. V egyptské studii prováděné otevřeným způsobem dostávalo 30 dětí s autismem probiotické doplňky po dobu tří měsíců. Po suplementaci analýza vzorků stolice pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) odhalila nárůst populace prospěšných bakterií, konkrétně Lactobacilli a Bifidobacteria. Kromě toho byla mezi účastníky pozorována pozoruhodná zlepšení v závažnosti symptomů autismu. Tato studie naznačuje, že probiotická intervence by mohla být slibná jako doplňková metoda ke zlepšení pohody jedinců s ASD. Pozorované pozitivní účinky na mikrobiální rovnováhu a závažnost symptomů poukazují na potenciální cestu pro zkoumání role probiotik při rozšiřování strategií léčby autismu. Probiotika a střevní mikrobiom u syndromu fragilního X (FXS). Role střevního mikrobiomu u syndromu fragilního X (FXS) zůstává do značné míry neprozkoumaná. Pokud je nám známo, vztah mezi FXS u lidí a střevní mikroflórou nebyl dosud posouzen. Data získaná ze studie Fragile X Online Registry with Accessible Database (FORWARD) však odhalila, že konzumace kojenecké výživy na bázi sóji je spojena se zvýšenou prevalencí autismu, GI problémů, alergií a závažnějším autistickým chováním souvisejícím s jazykem a sebeovládáním. škodlivé chování u jedinců s FXS. Je třeba poznamenat, že GI problémy byly nejčastějším uváděným důvodem pro přechod na kojeneckou výživu na bázi sóji s 25% uváděnou mírou užívání v populaci studie FORWARD, která je významně vyšší než u běžné populace. Jeden z možných mechanismů, které jsou základem účinků vyvolaných sójou u ASD a FXS, by mohl zahrnovat změněný střevní mikrobiom. Kromě toho existuje několik preklinických výzkumů, které zdůrazňují roli dysbiózy a/nebo probiotik ve zvířecích modelech FXS. Myší a lidská mikroflóra sdílí 89% podobnost v celkových bakteriálních rodech, což znamená, že výsledek by měl být realistický a přenositelný mezi druhy při modelování lidských onemocnění na zvířecích modelech. FXS je prominentním příkladem epigenetické dysregulace a představuje nejrozšířenější monogenní příčinu intelektuálního postižení (ID) a poruchy autistického spektra (ASD). Syndrom se objevuje v důsledku expanze prodloužené CGG trinukleotidové repetice přesahující 200 repetic, což vede k inhibici transkripce v důsledku hypermethylace promotoru a oblasti repetice v 5'-UTR genu fragilního X messenger ribonukleoproteinu 1 (FMR1). Výsledná absence nebo snížená exprese kódovaného genového produktu, FMRP, podporuje manifestaci FXS. Epigenetické umlčení FMR1, zprostředkované metylací DNA a modifikacemi histonů, které vedou ke ztrátě FMRP, rozšiřuje jeho vliv na celý genom a ovlivňuje různé nekódující RNA. V důsledku toho toto narušení ovlivňuje transkripci více genů klíčových pro synaptickou plasticitu a neuronální funkce, čímž přispívá k fenotypu FXS. Studie provedená v roce 2022 porovnávala epigenetické profily dvou odlišných skupin myší: jedné skupiny, která byla vystavena Lactobacillus reuteri během jejich prenatálního vývoje, a druhé skupiny, která dostávala placebo. Výzkum se zaměřil na 23 specifických genů známých svým zapojením do neurologických funkcí. Mezi těmito dvěma skupinami byla identifikována podstatná a statisticky významná disparita v methylačních vzorcích. Je důležité si uvědomit, že pozorované rozdíly v methylaci mohou být potenciálně ovlivněny genetickými variacemi vlastními myšímu modelu. Navzdory této možnosti získávají tato zjištění na věrohodnosti díky významným rozdílům zjištěným mezi kontrolní a experimentální skupinou, která zahrnovala náhodně roztříděné kamarády z vrhu. V důsledku toho byli vědci nakloněni připisovat tato zjištění vlivu změněné střevní mikroflóry, jak naznačují jejich výsledky.

2. Harmonogram studia Studie plánuje zapsat 15 účastníků s FXS ve věku 3-18 let. obě pohlaví, během 1 roku a dokončit všechny aktivity spojené se studiem do ledna 2025. Během 3měsíčního studijního období se subjekty zúčastní tří návštěv ve Speciální nemocnici pro dětskou mozkovou obrnu a vývojovou neurologii, Bělehrad, screening/základní, 6týdenní a 3měsíční návštěvy. Kromě toho budou rutinní telefonní hovory uskutečněny jednou týdně během prvního měsíce studie. Tato zkušební verze má jednomístný design. Všechny výsledky a data budou deidentifikována, aby byla chráněna důvěrnost výzkumného subjektu.

3. Cíle Primární cíl

1. Vyhodnotit účinnost probiotické směsi obsahující Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius a Bifidobacterium breve, podávané perorálně jednou denně po dobu 12 týdnů dětem se syndromem fragilního X (FXS) ve věku 3-18 let. na jejich chování a zpracování mozku.

   Sekundární cíle

2. Posouzení souvislosti mezi: (i) modifikacemi mikrobiomu probiotickou směsí, která obsahuje Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius a Bifidobacterium breve, podávanými perorálně jednou denně po dobu 12 týdnů a (ii) projevy chování u dětí ve věku 3 až 18 let s diagnózou FXS.

3. Posouzení souvislosti mezi: (i) modifikacemi mikrobiomu probiotickou směsí, která obsahuje Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius a Bifidobacterium breve, podávanými perorálně, jednou denně po dobu 12 týdnů a ii) zpracováním mozku (a. potenciální habituační paradigma související s událostmi a sledování sociálního pohledu pomocí Eye Tracker; b. EEG analýza) u dětí ve věku 3 až 18 let s diagnózou FXS.

   Expirační cíl 1. Analýzy složení mikrobiomu a posouzení jeho změn a modifikací (probiotickou směsí obsahující Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius a Bifidobacterium breve, podávané perorálně, jednou denně, po dobu 12 týdnů), které mohou vést ke klinice 4.Hypotéza: Denně zásah probiotickou směsí, která obsahuje Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius a Bifidobacterium breve povede k: (i) významným modifikacím mikrobiomu (zvýšená diverzita střevní mikroflóry a změny složení střevní mikroflóry ve směru prospěšných bakterií) a (ii) následně klinicky zlepšení u dětí, obou pohlaví, ve věku 3 až 18 let s diagnózou FXS během 3měsíčního léčebného období.

4. Hypotéza: Každodenní zásah probiotickou směsí obsahující Lactobacillus casei, Lactobacillus salivarius a Bifidobacterium breve povede k: (i) významným modifikacím mikrobiomu (zvýšená diverzita střevní mikroflóry a změny složení střevní mikroflóry ve směru prospěšných bakterií) a (ii) v důsledku toho ke klinickému zlepšení u dětí obou pohlaví ve věku 3 až 18 let s diagnózou FXS během 3měsíčního léčebného období.
5. Studovat design. Jedná se o otevřenou studii bez maskování, kde každý účastník dostává probiotika po dobu 3 měsíců (12 týdnů). Bude to jednoskupinové zadání. V tomto přístupu účastníci fungují jako vlastní kontroly měřením mikrobiomu a dalších parametrů před a po užití probiotik. Tento design byl vybrán, protože mikrobiom jednotlivce je vysoce personalizovaný. Dokonce i v rámci rodiny mohou mít jednotlivci odlišné mikrobiomy. Jedinečné složení mikrobiomu jedince může mít důsledky pro účinnost probiotik. Změny v analýzách a skóre mezi výchozím a 3měsíčním obdobím studie budou tedy posouzeny pro každého. Konkrétně budou zkoumány modifikace mikrobiomu, které mohou souviset se změnami v chování a zpracování mozku. Studie bude schválena IRB nemocnice.

Pacienti (až 15 jedinců ve věku 3–18 let, obě pohlaví) budou přijati a zařazeni do studie v rámci kliniky Fragile X ve Speciální nemocnici pro dětskou mozkovou obrnu a vývojovou neurologii v Bělehradě, Srbsko (více informací na: https:// fragilex.org/our-research/fragile-x-clinics/international-support-clinics/#serbia). Na začátku bude provedena podrobná anamnéza a fyzické a neurologické vyšetření, přičemž všechny léky a zdravotní problémy budou dokumentovány pro všechny účastníky. V prvních 4 týdnech bude každý pacient dostávat týdenní telefonát, aby se vyhodnotila snášenlivost probiotika a jakékoli nežádoucí účinky (AE). Návštěva 2 bude organizována po 6 týdnech a závěrečná návštěva 3 po 12 týdnech studijního období. Při návštěvách bude rovněž dokumentována jakákoli změna léků. Vyšetření a dokumentace AE se bude opakovat při každé návštěvě, zatímco CGI-I bude bodovat při návštěvě 2 a poslední návštěvě 3. Výsledky měření budou opakovány při poslední kontrolní návštěvě po 3 měsících/ukončení léčby. Vzorky stolice budou odebrány dvakrát, při základní a závěrečné návštěvě. Analýza mikrobiomu bude provedena jednou, na konci studie, kdy jsou odebrány všechny vzorky a odeslány do vybrané laboratoře. Kompletní harmonogram všech studijních procedur je také uveden v tabulkovém formátu níže. Vybraná probiotika. Všichni účastníci obdrží probiotickou směs, která obsahuje: (i) Lactobacillus casei BL 2401 (40 %), (ii) Lactobacillus salivarius BL 2201 (40 %) (iii) Bifidobacterium breve BL 3406 (20 %). Celkové množství je 5 x 109 CFU v jedné kapsli HPMC, na konci doby použitelnosti. Tyto kmeny jsou registrovány a uchovávány ve francouzské Národní sbírce kultur mikroorganismů (CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes). Jsou na seznamu EFSA QPS (Qualified and Presumption of Safety) a jsou považovány za bezpečné pro použití v potravinách a dietních produktech. Tato směs kmenů pro humánní použití bude díky svým vlastnostem působit jako pomůcka při terapii trávicích, kožních, respiračních a neurovývojových poruch s cílem vyrovnat imunitní odpověď a obnovit střevní mikrobiotu a střevní bariéru. Pomocí genetického mapování byly kmeny identifikovány podle fenotypových kritérií (morfologie, biochemické testování, podmínky, ve kterých rostou), ale také podle genotypových kritérií (sekvenování 16S rDNA). Ve studiích in vitro pro každý ze tří specifických kmenů bylo zkoumáno a stanoveno následující: (i) odolnost vůči podmínkám v trávicím traktu; (ii) adheze k buňkám střevní sliznice; iii) schopnost přežití a dlouhodobá stabilita; (iv) nepřítomnost přenosu genu pro rezistenci na antibiotika; (v) schopnost stimulovat sekreci IL-10 a (vi) antagonismus a inhibici růstu patogenních bakterií.

5. Správa dat a vzorků a důvěrnost Subjekty budou přijímány prostřednictvím kliniky Fragile X ve Speciální nemocnici pro dětskou mozkovou obrnu a vývojovou neurologii, Bělehrad, Srbsko. Potenciální subjekty, které mají zájem o účast ve studii, budou předem prověřovány buď telefonicky, nebo na místě výzkumným týmem. To také umožní potenciálním subjektům klást otázky související se studií a diskutovat o studii do hloubky s výzkumným týmem. Kontrola zdravotních záznamů subjektů je pro omezené informace a pouze pro určení způsobilosti. Údaje jsou odvozeny z klinicky indikovaných postupů a pro subjekt je zde minimální riziko. Přístup k lékařským záznamům bude mít pouze výzkumný personál. Bez počáteční kontroly lékařské dokumentace pro účely screeningu by nebylo možné identifikovat potenciální subjekty a potvrdit jejich použitelnost pro účast ve studii. Jakmile bude potvrzena způsobilost, budou subjekty osloveny, aby získaly jejich oprávnění k přístupu a používání jejich zdravotních informací pro výzkum. Studijní záznamy každého účastníka budou uloženy v tabulce výzkumu a informace o subjektu budou kódovány, aby byla chráněna důvěrnost. Všechny grafy budou uloženy v uzamčené skříni nebo uzamčené kartotéce. Identifikátory používané k identifikaci subjektů budou uchovávány v uzamčených kancelářích a/nebo uzamčených skříních a elektronická databáze obsahující osobní údaje bude uchovávána na zabezpečené počítačové síti přístupné pouze výzkumnému týmu PI. Pro správu dat využijeme systém REDCap (Research Electronic Data Capture). r. Systém REDCap se skládá z bezpečných webových aplikací, které jsou dostatečně flexibilní, aby mohly být použity pro různé typy výzkumu, poskytují intuitivní rozhraní pro uživatele pro zadávání dat a mají pravidla ověřování v reálném čase (s automatickou kontrolou typu dat a rozsahu ) v době vstupu. Tyto systémy nabízejí snadnou manipulaci s daty s auditními záznamy pro hlášení, monitorování a dotazování záznamů pacientů a také automatický exportní mechanismus do běžných statistických balíků (SPSS, SAS, Stata, R/S-Plus). Zdravotní informace subjektů spolu s identifikátory budou uchovávány u zkoušejícího až do ukončení studie nebo do okamžiku, kdy již nebude vyžadován okamžitý přístup. Poté mohou být informace přeneseny do záznamů pro dlouhodobé uložení. Když vyšetřovatel nebo jakékoli regulační orgány již nebudou vyžadovat informace (ale ne dříve než 5 let), dokumenty budou bezpečně skartovány. Všichni pracovníci studie budou mít přístup ke studijním záznamům, datům a vzorkům. V případě potřeby bude zástupcům IRB zpřístupněn přístup ke studijním záznamům a datům. Zapsané subjekty budou informovány, že studijní personál a zástupci IRB budou mít přístup k jejich záznamům. To bude součástí formuláře souhlasu a bude také důkladně přezkoumáno během procesu souhlasu. Všichni výzkumní pracovníci budou mít aktuální školení GCP pro vyšetřovatele a pracovníky zapojené do výzkumu zahrnujícího lidské subjekty. Kromě toho se vynasnažíme zajistit, aby osobní a lékařské informace subjektu byly uchovány v soukromí; nemůžeme však zaručit úplné soukromí. Osobní a zdravotní údaje subjektu mohou být poskytnuty, pokud to vyžaduje zákon. Například nahlášení citlivých informací (jako je zneužívání dětí) místním úřadům v případě potřeby. Výsledky a data jsou z důvodu ochrany důvěrnosti pacienta deidentifikace. Analýza účinnosti léčby bude založena na změnách v analýzách a skóre mezi výchozím a 3měsíčním obdobím studie. Zvolený koncový bod po 3 měsících na základě předběžných údajů poskytuje přiměřené časové období pro posouzení změn v reakci a/nebo korelace mezi základními a následnými opatřeními. Rada pro bezpečnost a monitorování dat (DSMB) není pro takový výzkum nezbytná, pokud budou zkoumány účinky probiotik. Údaje a/nebo vzorky bankovních záznamů a dokumenty týkající se provádění této studie, včetně formulářů informovaného souhlasu, výsledků laboratorních testů a záznamů o zásobách léků, musí hlavní zkoušející uchovávat po dobu nejméně 5 let po dokončení nebo ukončení studie, nebo po dobu požadovanou příslušnými národními nebo místními zdravotnickými orgány, podle toho, která doba je delší. Po uplynutí této doby mohou být dokumenty zničeny v souladu s místními předpisy. Záznamy převedené na jinou stranu budou zbaveny identifikace. Vzorky stolice Banka: Všechny odebrané vzorky pro analýzy mikrobiomů budou deidentifikovány a budou obsahovat pouze identifikační číslo studie subjektu a datum/čas odběru. Biologické vzorky budou zpracovány, uloženy a zničeny v souladu s protokoly platnými pro biologické vzorky.

Odvolání subjektů Všechny subjekty a jejich rodiče/zákonní pověření zástupci budou informováni, že mohou kdykoli, z jakéhokoli důvodu a bez předsudků odstoupit od účasti v této studii. Zkoušející by měl učinit každý rozumný pokus o udržení subjektů ve studii; avšak subjekty musí být ze studie vyřazeny, pokud odvolají souhlas s účastí. Zkoušející se musí pokusit kontaktovat subjekty, které se nedostaví na plánované návštěvy, telefonicky nebo jinými prostředky, aby se vyloučila možnost, že AE je příčinou odstoupení. Pokud by toto byla příčina, AE musí být zdokumentována, hlášena a sledována. Zkoušející má také právo kdykoli odvolat subjekty ze studie pro nedostatek terapeutického účinku, který je pro subjekt netolerovatelný nebo jinak nepřijatelný, pro netolerovatelné nebo nepřijatelné AE, interaktuální onemocnění, nedodržování postupů studie, administrativní důvody, popř. podle názoru vyšetřovatele chránit nejlepší zájem subjektu. Pokud je subjekt odvolán před dokončením studie, důvod odstoupení a datum přerušení se zaznamenají do příslušného formuláře kazuistiky. Informace shromážděné o subjektu, který předčasně ukončil studii, stejně jako všechny vzorky krve a stolice, budou uchovány pro analýzu, pokud pečovatelé subjektu výslovně nepožádají o odstranění těchto informací z analýzy. Pečovatelé o tom budou informováni v rámci procesu souhlasu a také připomenutí v případě předčasného ukončení.

Rizika pro subjekty Mezi nejčastější očekávaná rizika vyplývající z účasti ve studii patří úzkost, frustrace, únava nebo rozpaky během odpovídání na dotazníky, hodnocení studie a testování, stejně jako během anamnézy a vyšetření. Předmětům budou nabídnuty přestávky podle potřeby. Rizika spojená s odběry krve zahrnují modřiny, bolestivost a mírné riziko infekce v místě vpichu jehly pro odběr krve. Toto místo bude před losováním pečlivě vyčištěno a na místo bude aplikován vhodný obvaz. Probiotika mohou způsobit mírné žaludeční potíže, zejména v prvních dnech, kdy je dítě začne užívat. Děti mohou mít žaludeční nevolnost, plynatost, průjem. Tyto příznaky obvykle odezní, jakmile si na ně tělo zvykne.

Pracovníci studie budou během prvního měsíce uskutečňovat týdenní telefonáty, aby vyhodnotili přítomnost vedlejších účinků. .

Potenciální přínosy pro subjekty Potenciální přínosy účasti ve studii jsou, že subjekty s FXS: 1. mohou zaznamenat zlepšení fyzického zdraví, symptomů chování a/nebo kognitivních schopností v důsledku léčby probiotiky; 2. podstoupí neuropsychologická vyšetření, jejichž výsledky mohou být na požádání zpřístupněny rodině účastníků; 3. podstoupí lékařské prohlídky nabízené studiem. Kromě toho bude jako součást této studie proveden kompletní krevní obraz. Účastníci budou informováni o klinicky významných nálezech buď z lékařské prohlídky, nebo podle potřeby z CBC4. obdrží analýzy mikrobiomů nabízené v rámci studie. Účastníci budou informováni o klinicky významných nálezech. 5. pochopí, že přispívají k vědeckým poznatkům, které mohou vést k rozšíření možností cílené léčby pro subjekty s FXS.

Žádné další výhody účasti se nepředpokládají.