Biomarcadores iniciais em portadores de genes da doença de Huntington pré-manifestada: um estudo piloto (BIO-MH)

A doença de Huntington (DH) é uma doença autossômica dominante, neurodegenerativa e fatal, causada por uma mutação no gene da hungtingtina (HTT),1 que se manifesta por distúrbios neurológicos, psiquiátricos e cognitivos. A doença causa grave comprometimento físico, funcional e social, com grande impacto na qualidade de vida dos pacientes e de seus cuidadores. Até o momento, a fisiopatologia da DH permanece em grande parte desconhecida. A degeneração neuronal dos gânglios da base desempenha um papel fundamental na causa de sintomas neuropsiquiátricos. No entanto, um envolvimento cortical tem sido evocado na gênese de outros sintomas da doença, como distúrbios do sistema visual.2 Até o momento, apenas o tratamento sintomático está disponível para problemas motores e psiquiátricos em pacientes em HD. O campo de pesquisa está agora focado na investigação de estratégias genéticas neuroprotetoras para prevenir a progressão da doença.3 O objetivo terapêutico ideal seria iniciar o tratamento assim que a doença se tornasse sintomática, uma vez que a mutação da DH está presente desde o nascimento. Infelizmente, a idade e os sintomas de início são muito variáveis, principalmente relacionados com o tamanho da mutação4, mas não só. Pensa-se que vários outros factores genéticos e ambientais desempenham um papel na transição da fase pré-sintomática para a fase sintomática, que permanece em grande parte imprevisível.5 Além disso, o diagnóstico de DH sintomática é tradicionalmente baseado no início dos sintomas motores (coreia, distonia, bradicinesia, problemas de coordenação).6 Existem algumas evidências de que alterações estruturais sutis na ressonância magnética cerebral e problemas cognitivos e psiquiátricos leves podem estar presentes mesmo na fase pré-sintomática, sugerindo que a fase sintomática pode começar antes do início dos sintomas motores clássicos.7 Estudos clínicos utilizando ressonância magnética morfológica e funcional demonstraram recentemente um envolvimento precoce do córtex visual (área associativa visual, córtex occipital lateral), o que pode explicar os distúrbios da função visuoespacial e da percepção visual já observados na fase pré-sintomática e sintomática inicial da HM.8 O colículo superior (CS) é uma estrutura mesencefálica envolvida na integração de estímulos visuais, na geração de sacadas oculares orientadas e em tarefas de atenção.9 Uma disfunção precoce do CS tem sido demonstrada em outras doenças dos gânglios da base, como a doença de Parkinson (DP)10 e a distonia focal.11 Essa estrutura também pode estar envolvida precocemente na patogênese dos distúrbios visuais e das alterações oculares sacádicas descritas na DH.12 Até o momento, não há dados sobre o estado funcional do SC em resposta a estímulos visuais na DH.

Problemas de marcha e equilíbrio na DH são comuns na fase sintomática da doença, sendo um grande risco de quedas juntamente com movimentos involuntários anormais.13 Podem estar presentes na fase inicial da doença, com gravidade leve. Até o momento, não há dados disponíveis sobre avaliação específica da marcha em portadores de DH pré-sintomáticos. Problemas sutis de marcha que resultam em alteração dos parâmetros espaço-temporais, não detectáveis ​​pelo exame clínico padrão, podem estar presentes mesmo em portadores assintomáticos do gene da DH. Novas tecnologias baseadas em ferramentas de realidade virtual 3D podem ser de grande interesse no diagnóstico de problemas de marcha muito precoces em indivíduos com DH pré-sintomáticos.

Problemas cognitivos também são comuns na DH, variando desde comprometimento cognitivo leve em indivíduos pré-manifestos14 até demência na doença avançada.15 O comprometimento cognitivo e emocional está relacionado à degeneração dos gânglios da base na DH, envolvendo progressivamente as regiões límbicas frontal e subcortical.16 Os dados de rastreamento ocular são conhecidos por serem bons marcadores da orientação da atenção. Recentemente, nossa equipe demonstrou que a DP está associada principalmente à disfunção do SC.10,17 Ao mesmo tempo, pacientes com DP têm dificuldade em produzir e reconhecer expressões emocionais faciais e vocais e são menos reativos a estímulos negativos do que HS.18 Como a DP e a DH partilham disfunções semelhantes na rede dos gânglios da base, podem partilhar também alterações cognitivas e emocionais semelhantes, que podem estar presentes desde o início da DH, devido a défices estruturais e/ou funcionais nas áreas límbicas frontais e subcorticais. Até o momento, nenhum estudo investigou o comportamento emocional e as reações de orientação correlacionadas com o protocolo funcional específico de ressonância magnética (fMRI) em portadores de DH pré-sintomáticos.

Objetivos:

O objetivo principal do nosso estudo é investigar a função do SC em resposta à estimulação visual usando uma fMRI em portadores pré-manifestos do gene HD (PMGC) em comparação com indivíduos saudáveis ​​(HS). Nossa hipótese principal é a disfunção do SC na fase pré-sintomática da doença (papel do SC como biomarcador precoce da doença).

Os objetivos secundários serão:

1. Estudar parâmetros de marcha utilizando equipamento de realidade virtual 3D no PMGC comparado ao HC, para demonstrar que estão anormais na fase pré-sintomática da doença.
2. Investigar o comportamento cognitivo/emocional no PMGC comparado ao HC, para demonstrar que ele é anormal na fase pré-sintomática da doença.
3. Estudar a correlação entre marcha, neuroimagem, dados cognitivos/emocionais e diversas variáveis ​​clínicas e neuropsicológicas.
4. Investigar potenciais perfis de subtipos pré-sintomáticos em portadores de HD, com base em análises de correlação de avaliações de neuroimagem, clínicas, cognitivas/emocionais.

Metodologia:

Nosso estudo é um estudo piloto prospectivo, unicêntrico, caso-controle. Serão incluídos dez PMGC e dez HS pareados por idade (+/- 5 anos) e sexo. Os principais critérios de inclusão serão: 1. Para PMGC: diagnóstico de HD confirmado por teste genético (trigêmeos CAG ≥36 no gene HTT); Escala Unificada de Avaliação da Doença de Huntington19 Pontuação Motora Total (UHDRS-TMS) ≤ 5; idade entre 18 e 70 anos. 2. Para HC: exame neurológico normal; idade entre 18 e 70 anos. Os principais critérios de exclusão para PMGC e HS serão: principais doenças oftalmológicas e psiquiátricas ativas; comprometimento cognitivo (Avaliação Cognitiva de Montreal, pontuação MoCA < 25/30); problemas de marcha relacionados a condições não neurológicas; contra-indicações para ressonância magnética cerebral.

Desenho do estudo:

Seleção da população do estudo e inclusão no estudo (V0). O PMGC será selecionado na Unidade de Distúrbios do Movimento do Hospital Universitário de Grenoble durante uma consulta neurogenética após testes genéticos realizados no Serviço de Genética do CHU Grenoble Alpes. HS será recrutado por meio de anúncios publicados no site de ciências cognitivas do CNRS (http://www.risc.cnrs.fr/), e publicado no Serviço de Neurologia, nos laboratórios de investigação pertencentes à UGA e no site da associação de doentes em Huntington (https://huntington.fr). O consentimento informado para o estudo será assinado pelos participantes. Os critérios de inclusão e exclusão serão verificados e a avaliação neurológica será realizada por neurologista experiente em distúrbios do movimento.

Consulta oftalmológica (V1). O PMGC e o HS realizarão exame oftalmológico (medição de acuidade visual, fundo de olho, campo visual). O intervalo de tempo máximo entre V0 e V1 será de 1 mês.

Avaliação neuropsicológica (V2). Uma avaliação neuropsicológica completa será realizada no PMGC por um neuropsicólogo experiente em distúrbios do movimento, incluindo: a. avaliação das funções executivas por meio do escore frontal, Stroop Delis-Kaplan, sequência de letras/números (versão oral do TMT); b. Avaliação de memória utilizando WAIS IV, blocos de Corsi, RL/R116 e teste de Doors; c. Avaliação das funções instrumentais com os itens do BJLO-15, VOSP, BECS; d. Avaliação comportamental com BDI-II, LARS, SHAPS, STAI, UHDRS (parte psicocomportamental).

Sessão de ressonância magnética funcional (V3). Indivíduos pré-sintomáticos e HS realizarão uma sessão de fMRI. O intervalo de tempo entre V2 e V3 será definido entre 2 semanas e 2 meses. As aquisições de fMRI serão realizadas durante 1 hora sob estimulação visual, conforme protocolo desenvolvido por nossa equipe.

Avaliação da marcha (V4). Os parâmetros de marcha de PGMC e HS serão avaliados durante visita de 1 hora por meio de equipamento 3D especial na Unidade de Distúrbios do Movimento. O intervalo de tempo entre V3 e V4 será definido entre 2 semanas e 2 meses.

Avaliação cognitiva/emocional (V5). A população do estudo realizará duas sessões experimentais diferentes: uma usando rastreamento ocular para uma tarefa envolvendo exploração livre de estímulos emocionais e outra usando fMRI juntamente com rastreamento ocular para tarefas baseadas em sentimentos emocionais e na tendência de agir. O intervalo de tempo entre V4 e V5 será definido entre 2 semanas e 2 meses.

Após o V5, o estudo será encerrado. Avaliação de neuroimagem O procedimento de neuroimagem inclui: ressonância magnética anatômica e de perfusão cerebral e fMRI com protocolo de estimulação visual.8 Procedimento de ressonância magnética. As aquisições de ressonância magnética serão realizadas nas instalações de ressonância magnética IRMaGE em Grenoble usando um scanner de ressonância magnética Philips Achieva de 3 Tesla de corpo inteiro equipado com uma bobina de cabeça SENSE de 32 canais. Os participantes serão orientados a fixar uma cruz localizada no centro de uma tela diante de seus olhos, na qual são apresentados os estímulos visuais para controle das sacadas oculares. Durante cada sessão funcional, o PRL e os movimentos oculares serão monitorados usando o rastreador ocular ASL 6000. Para manter e controlar a atenção, cada participante será instruído a apertar um botão quando a orientação da cruz mudar. O protocolo de estimulação visual compreende uma série de tabuleiros de xadrez acromáticos com quatro níveis de contraste de luminância (1%, 3%, 5% e 9%) e piscando na frequência de 4Hz sobre fundo cinza. Cada execução de fMRI é composta por quatro blocos de 12 segundos de estimulação visual, um para cada contraste (Figura 1), e cinco intervalos de fixação de 12 segundos. A sessão completa de ressonância magnética funcional é composta por nove execuções de varredura, levando a 36 apresentações em blocos aleatórios de cada nível de contraste de luminância. O sinal cardíaco é registrado indiretamente com base no pulso hemodinâmico na ponta do dedo usando a unidade de pletismografia de pulso anexada ao scanner de ressonância magnética.

Sequências de ressonância magnética. Medições funcionais, anatômicas e de perfusão serão realizadas durante cada sessão de ressonância magnética. Para varreduras funcionais, uma sequência de imagem planar gradiente eco padrão será usada. Serão adquiridos 25 cortes (1,5 mm) cobrindo o SC, o núcleo geniculado lateral (LGN) e o córtex da área visual primária (V1). Imagens estruturais de alta resolução serão adquiridas usando sequências 3D MP-RAGE e FGATIR ​​ponderadas em T1 e usadas para delineamento manual de nossas regiões de interesse (ROI) (Figura 2). Uma sequência de rotulagem arterial pseudo-contínua (ASL) de todo o cérebro será usada para medir a perfusão do tecido cerebral.

Avaliação da marcha

A avaliação do protocolo de marcha será realizada utilizando equipamento 3D específico desenvolvido pela empresa Social Dreams®. Este equipamento já se encontra disponível no mercado, com autorização CE (www.socialdreams.fr). Foi aplicado em estudos clínicos em andamento que investigam a função da marcha e a estimulação cognitiva em pacientes com doença de Alzheimer no Serviço Geriátrico do CHU de Lyon, França. Dados ainda não publicados). O equipamento inclui:

1. PERCEPTION NEURON3 (PN3, figura 3): um conjunto integrado de captura de movimento multisensor corporal, capaz de capturar qualquer movimento corporal, sem restrições de espaço, iluminação ou ambiente. O “Kit Corporal” PN3 inclui: Sensores Corporais PN3 (17); Sensor Sobressalente PN3 (1); Transceptor USB PN3 (1); Alças corporais (1 conjunto); Docas de Carregamento (3); Dongle de licença do Axis Studio (1); Cabo USB-A para USB-C (3); USB-A Macho para USB-C Fêmea; Software de captura e gravação Axis Neuron.
2. PICOG3 (figura 4): headset 3DOF VR com tela 4K e sistema de áudio integrado, com seis graus de liberdade, capaz de rastrear os movimentos da cabeça e do corpo, e reproduzi-los em Realidade Virtual com precisão realista, sem sensores externos obrigatório. O kit inclui também: um roteador TP-LINK TL-WR902AC sans fil Dual-Band Wi-Fi AC (AC430+ N300); um tablet tátil Lenovo Tab P11 - 11'' 2K LCD (Processador Qualcomm Snapdragon 662 8Coeurs, 4 GB de RAM, UFS 64 GB, GPU Qualcomm Adreno 610, Android 10, 4G LTE, WiFi+Bluetooth); dois joysticks.

Os parâmetros espaço-temporais da marcha serão avaliados durante três sessões diferentes (5 minutos/sessão). Será realizada uma pausa de 5 minutos entre cada sessão. Serão criados três cenários 3D diferentes, com níveis de dificuldade de marcha crescentes (obstáculos, voltas…), e projetados através do headset PICOG3 para cada uma das três sessões.

Avaliação cognitiva/emocional

1. A sessão de fMRI será realizada nas instalações de ressonância magnética IRMaGE em Grenoble (ver avaliação de neuroimagem).

   Estímulos: A tarefa de fMRI envolverá a visualização individual de fotografias coloridas de cenas naturais. Essas fotografias serão tiradas do banco de dados de imagens selecionado para o estudo de rastreamento ocular descrito abaixo. Eles incluirão 60 estímulos negativos, 60 estímulos positivos e 60 estímulos neutros divididos em 2 grupos de estímulos: um grupo (gr1High) incluirá estímulos emocionais negativos e positivos de alta ativação e estímulos neutros e o outro grupo (gr2Blow) incluirá baixa- ativação de estímulos emocionais negativos e positivos e estímulos neutros.

   Os estímulos serão projetados em uma tela na parte traseira do ímã, que os participantes poderão visualizar por meio de um espelho acoplado à antena de radiofrequência da cabeça.

   Experimentação. A experiência terá duração máxima de 1 hora, incluindo tempo de montagem, sessões e intervalos. Cada participante realizará 2x2 exames de ressonância magnética funcional (duração total de 22 minutos): 2 exames serão realizados com estímulos de alta ativação (grp1High) e outros 2 com estímulos de baixa ativação (grp2Blow). A ordem das varreduras dos 2 tipos de estímulos (alta e baixa ativação) será alternada entre PMGC e HS. Cada scan apresentará uma sucessão de fotografias de cenas naturais de valência negativa, positiva e neutra (30 de cada) e eventos nulos (fixação cruzada substituindo a fotografia no ensaio) segundo um paradigma misto. Cada fotografia será apresentada durante 1 segundo, intercalada com uma cruz de fixação com duração de 1500 ms. As 2 varreduras de cada tipo de estímulo serão diferenciadas pela natureza da tarefa a ser realizada: tarefa emocional ou tarefa de tendência de ação. Na tarefa emocional, o participante terá que indicar a sua experiência emocional para cada cena com a maior rapidez e precisão possível assim que a fotografia aparecer, ou seja, terá que decidir, para cada tentativa, se a cena é desagradável, agradável ou neutra (sem emoção) pressionando o botão de resposta correspondente. Durante a tarefa de tendência de ação, o participante terá que indicar a ação que tomaria se estivesse envolvido nesta situação na realidade, o mais rápido e preciso possível assim que a fotografia aparecer, ou seja, ele terá que decidir, para cada tentativa, se ele iria se afastar (evitar), se aproximar ou não se mover, pressionando o botão de resposta correspondente. Cada tarefa envolverá 3 opções de resposta correspondentes a 3 opções de botão. A atribuição dos botões às 3 emoções (tarefa emocional) ou às 3 tendências de ação (tarefa de ação) será previamente indicada aos participantes e será contrabalançada entre os participantes. As respostas do participante e os tempos de resposta serão registrados para cada tentativa. Os participantes serão familiarizados com cada tarefa previamente, utilizando ensaios de treinamento diferentes daqueles utilizados no experimento. As regiões cerebrais de interesse seletivas para o processamento emocional serão identificadas funcionalmente para cada participante, realizando uma varredura 'localizadora' de 5 minutos. Os participantes visualizarão fotografias e embaralhamentos (montagem aleatória de peças de cena) de cenas naturais de valência negativa (cenas de mutilação) e valência neutra (ambientes, casas) em blocos separados de um paradigma de bloco e serão solicitados a indicar quando 2 fotografias idênticas se seguirem. uns aos outros. Ao longo das aquisições de fMRI (exceto durante o localizador), as posições e movimentos dos olhos serão registrados usando um oculômetro. O procedimento de calibração antes de cada varredura funcional e durante o experimento será idêntico ao descrito no experimento anterior de rastreamento ocular. Entre as 2 séries de exames, uma ressonância magnética anatômica de alta resolução de 4 minutos será adquirida para normalizar os dados de ressonância magnética (registro) entre as varreduras do mesmo participante e entre os participantes. A execução experimental na ressonância magnética será completada pela aquisição de uma imagem de perfusão de 8 minutos e uma imagem de difusão (DTI) de 8 minutos otimizada para o sistema visual. A imagem de perfusão nos permitirá garantir que o sinal BOLD seja interpretado em boas condições de perfusão. Durante a ressonância magnética anatômica e o DTI, os participantes assistirão a um filme para passar o tempo ou poderão fechar os olhos se desejarem. Ao final das aquisições de ressonância magnética, após um intervalo, o participante realizará uma tarefa final de avaliação subjetiva de fotografias emocionais (200), incluindo as utilizadas no estudo de fMRI, durante no máximo 20 minutos. A tarefa envolverá avaliar com precisão o nível de valência, ativação e tendência de ação de cada fotografia. Esta avaliação ajudará a refinar as análises dos dados de fMRI e a estabelecer um banco de dados de imagens normativo para pacientes com Parkinson de novo para estudos futuros.

2. Avaliação do eyetracker: os movimentos oculares serão medidos durante as sessões de ressonância magnética usando o EyeLink 1000 plus compatível com ressonância magnética (SR Research). O diâmetro pupilar, sacadas e piscadas serão quantificados usando o software EyeLink. O mesmo equipamento está disponível fora da ressonância magnética para medições de controle comportamental.

Análise estatística O resultado primário do estudo é a medição das alterações do sinal BOLD (dependente do nível de oxigênio no sangue) usando fMRI (3 Tesla), em duas regiões subcorticais, SC, LGN e V1 em resposta a estímulos visuais, em PMGC em comparação com HS . A análise do sinal BOLD para estes três ROIs será feita para ambos os hemisférios juntos. Será realizada uma correção de Bonferroni entre os níveis de luminância. O teste de Friedman será utilizado para analisar os efeitos das mudanças no contraste de luminância de cada ROI dentro de cada grupo. O teste de Mann-Whitney será utilizado para comparar entre os grupos a resposta de cada ROI para cada contraste de luminância. A análise de variância (ANOVA) será utilizada para avaliar os dados de perfusão cerebral dentro e entre grupos e regiões de interesse (SC, LGN e V1). Como o SC também está envolvido no controle das sacadas oculares voluntárias e reflexivas, investigaremos os movimentos oculares durante o estudo de ressonância magnética. O número de sacadas para cada participante será calculado a partir da análise do sinal oculomotor. O número de detecções bem-sucedidas das alterações cruzadas centrais durante a tarefa de atenção entre os dois grupos será analisado pelo teste de Mann-Whitney.

Com relação ao tamanho da amostra, nosso estudo anterior demonstrou que, ao utilizar nosso paradigma específico de fMRI em 20 indivíduos, o tamanho do efeito foi suficiente para permitir uma análise estatística robusta da modulação do sinal BOLD nas estruturas visuais de interesse8. Uma análise de poder realizada nos dois grupos de estudo mostra que o número de sujeitos envolvidos poderia permitir tirar conclusões válidas (poder G = 0,94). Todas as análises estatísticas serão realizadas pela Equipe de Neuroimagem (plataforma de pesquisa IRMAGE, GIN).

Os resultados secundários são:

1. Medição dos parâmetros espaço-temporais da marcha (tempo de apoio, tempo de balanço, tempo de suporte duplo, tempo de passada, comprimento da passada e comprimento do passo) durante os três diferentes cenários visuais 3D desafiadores da marcha no PMGC em comparação com HS. A análise desses dados será realizada utilizando softwares dedicados Axis Neuron e um pacote de software de análise musculoesquelética desenvolvido em MATLAB®.

2. Comparação de medidas comportamentais, tempos de reação e taxas de resposta congruentes entre PMGC e HS.

   Sessão de rastreamento ocular: A taxa média de orientação da primeira sacada e a latência média da primeira sacada serão analisadas estatisticamente para cada valência emocional de acordo com o nível de ativação e tipo de par usando uma ANOVA de medidas repetidas com população (pacientes e controles saudáveis) como uma variável entre sujeitos e nível de ativação (ALTO e BAIXO) e valência do estímulo de acordo com pares (NEG com positivo, NEG com neutro, POS com negativo, POS com neutro, NEU com positivo e NEU com negativo) como variáveis ​​intra-sujeitos. As comparações de médias foram avaliadas por meio do teste post-hoc de Tukey. Para todas as análises estatísticas, o limite de significância será de 0,05. Quanto aos demais parâmetros oculomotores, serão considerados dois níveis de análise: análise ao longo do tempo total de apresentação dos pares de estímulos e por período de tempo. Para cada participante e cada condição experimental (tipos de pares, intensidade dos estímulos), serão calculados os valores médios dos diferentes parâmetros considerados (duração das fixações, taxa e dispersão das sacadas oculares para cada estímulo de cada par) ao longo da duração total. de apresentação dos pares de cenas e analisados ​​estatisticamente para cada valência emocional (negativa, positiva e neutra) de acordo com o tipo de par e nível de ativação do estímulo usando uma ANOVA de medidas repetidas com população (pacientes e controles saudáveis) como variável entre sujeitos e ativação nível (ALTO e BAIXO) e valência de estímulo de acordo com pares (NEG com positivo, NEG com neutro, POS com negativo, POS com neutro, NEU com positivo e NEU com negativo) como variáveis ​​intra-sujeitos. As comparações de médias foram avaliadas por meio do teste post-hoc de Tukey. Para todas as análises estatísticas, o limite de significância será de 0,05.

   Medições de rastreamento ocular do estudo fMRI: serão extraídos parâmetros semelhantes ao estudo de rastreamento ocular 1, como a latência da primeira sacada e a taxa e duração das fixações para cada estímulo. Eles serão analisados ​​estatisticamente por meio de ANOVA de medidas repetidas tendo a população (pacientes vs controles) como variável entre sujeitos e a tarefa (tendência emocional e de ação), o nível de ativação (alto e baixo) e a valência dos estímulos (negativo , positivo, neutro) como as variáveis ​​dentro dos sujeitos. As comparações de médias foram avaliadas por meio do teste post-hoc de Tukey. Para todas as análises estatísticas, o limite de significância será de 0,05. Análises de correlação também serão consideradas entre dados de rastreamento ocular e dados de fMRI. Os dados de rastreamento ocular também nos permitirão eliminar correlatos neurais de ativação ligados a piscadas palpebrais.

   Dados comportamentais: Os tempos de reação (em ms) e a porcentagem de respostas "corretas" serão analisadas estatisticamente (ANOVAs, testes post-hoc de Tuckey) com o grupo de participantes (pacientes, controles) como um fator dentro dos sujeitos e a tarefa, valência e nível de ativação dos estímulos como fatores entre sujeitos.

3. Estudo de correlação de dados Os dados das diversas avaliações (marcha, neuroimagem, cognitiva/emocional) serão avaliados em relação às diversas variáveis ​​clínicas (ex. idade, escores motores, etc.) e variáveis ​​neuropsicológicas usando análises de correlação. O estudo correlativo dos escores neuropsicológicos com biomarcadores estruturais e fisiológicos pode ajudar a identificar novas formas de discriminar os perfis individuais de indivíduos pré-sintomáticos em HD.
4. Estimativa de subtipos de indivíduos com DH pré-sintomáticos:

Outras análises baseadas em métodos de classificação estatística serão consideradas com base nos diversos dados adquiridos (funcionais, estruturais, conectividade efetiva, dados de atividade oculomotora, etc.) a fim de identificar características ou índices de características que discriminem subtipos de DH pré-sintomática. assuntos.