Пилотное исследование перенаправленных инфузий гаплоидентичных натуральных клеток-киллеров для лечения острого лимфобластного лейкоза B-линии

1.0. Обоснование

В отличие от хорошо известной цитотоксичности NK-клеток в отношении клеток AML, их способность лизировать ВСЕ клетки, как правило, низка и ее трудно предсказать. Мы стремились преодолеть эту внутреннюю устойчивость путем трансдукции CD56+ CD3-NK-клеток химерными рецепторами, направленными против CD19, молекулы, широко экспрессируемой злокачественными В-клетками. Экспрессия анти-CD19-рецепторов, связанных с CD3zeta, преодолевала резистентность NK-клеток и заметно усиливала опосредованное NK-клетками уничтожение лейкемических клеток. Этот результат был значительно улучшен при добавлении костимулирующей молекулы 4-1BB к химерному анти-CD19-CD3zeta-рецептору: цитотоксичность, продуцируемая NK-клетками, экспрессирующими эту конструкцию, единообразно превышала таковую у NK-клеток, чьи сигнальные рецепторы отсутствовали 4-1BB, даже при естественной цитотоксичности. было очевидным (Imai et al., Blood 2005). NK-клетки, экспрессирующие анти-CD19-рецепторы, также проявляли активную активность против ALL в мышиной модели лейкемии (Shimasaki et al., Cytotherapy 2012). Наши результаты показывают, что принудительная экспрессия сигнальных рецепторов NK-клетками может обходить ингибирующие сигналы, предоставляя новые средства для повышения эффективности терапии против ALL NK-клеток.

Высокая противолейкемическая эффективность генетически модифицированных NK-клеток, показанная в наших доклинических исследованиях, наряду с продемонстрированной возможностью введения прочных гаплоидентичных NK-клеток в условиях, не связанных с ТГСК, и установленным опытом команды NUH в области клеточной терапии (единственный центр в Азия, аккредитованная Фондом аккредитации клеточной терапии, FACT), являются убедительным обоснованием для клинических испытаний этих NK-клеток.

Подготовка ключевого реагента (мРНК анти-CD19-BB-зета) завершается в лаборатории тканевой инженерии и клеточной терапии (TECT) в NUH, где находится электропоратор MaxCyte, соответствующий требованиям GMP. Была продемонстрирована возможность крупномасштабной экспансии NK-клеток (Shimasaki et al. Cytotherapy 2012), и возможность крупномасштабной электропорации подтверждена в лаборатории TECT.

Мы будем использовать технологии проточной цитометрии и MRD для определения наличия персистирующего заболевания и будем включать в это исследование только пациентов с ограниченным количеством остаточных заболеваний (<1% лейкемических лимфобластов среди нормальных клеток костного мозга). Мы будем использовать те же методы MRD для мониторинга эффектов лечебных инфузий. Мы не ожидаем, что режим кондиционирования сам по себе окажет большое влияние на количество лейкемических клеток, поскольку у пациентов, подходящих для исследования, будет заболевание, устойчивое ко многим противолейкемическим препаратам. Тем не менее, поскольку режим кондиционирования сам по себе может иметь некоторые благотворные эффекты, важно проводить скрининг периферической крови и/или костного мозга на наличие лейкемических бластных клеток на всех этапах процедуры, т. е. до, во время и после кондиционирования. и после инфузии NK-клеток. Присутствие лейкемических клеток будет тщательно контролироваться с помощью проточной цитометрии или ПЦР-амплификации генов антиген-рецептора (чувствительность для любого метода: 1 лейкемическая клетка на 10 000), чтобы пролить свет на относительный эффект каждого вмешательства.

2.0. Гипотеза и цели

Основная гипотеза, подлежащая проверке в этом исследовании, заключается в том, что инфузия NK-клеток, экспрессирующих анти-CD19-BB-дзета-рецепторы, путем электропорации может вызывать измеримые клинические ответы у пациентов с резистентным ОЛЛ В-линии.

3.0. Основные цели

• Определить возможность и безопасность перенаправления NK-клеток с помощью химерного антигенного рецептора против CD19 с помощью электропорации мРНК в клинических условиях.
• Определить эффективность анти-CD19-перенаправленных NK-клеток у участников исследования с ОЛЛ B-линии, которые имеют персистирующее заболевание, определяемое методами MRD после интенсивной химиотерапии.

4.0. Второстепенные цели

• Изучить персистенцию и фенотип перенаправленных NK-клеток у участников исследования с ОЛЛ B-линии, у которых есть резидуальное заболевание после интенсивной химиотерапии.

5.0. Конечные точки

В этом исследовании ответ на лечение будет измеряться путем сравнения уровней MRD до и через несколько интервалов после инфузии NK-клеток. Достижение MRD-отрицательного результата в костном мозге, т. е. < 0,01% бластов с помощью проточной цитометрии или ПЦР, будет рассматриваться как полный ответ. . Частичный ответ будет определяться как снижение уровней MRD на ≥ 1 log, в то время как снижение уровней MRD на <1 log будет рассматриваться как отсутствие ответа.

Основываясь на предыдущих исследованиях, донорские NK-клетки в большинстве случаев будут элиминированы за счет возрождения клеточного иммунитета гаплоидентичного реципиента после прекращения эффектов временной иммуносупрессии, вызванной режимом кондиционирования (обычно в течение 1 месяца после инфузии). Однако возможно, что приживление NK-клеток может сохраняться в течение более длительного периода с возможным риском длительной панцитопении из-за уничтожения NK-клеток на нормальных гемопоэтических клетках. Из-за этой возможности мы будем планировать спасательную ТГСК у пациентов, получающих перенаправленные инфузии NK-клеток. Действительно, для большинства пациентов, подходящих для этого исследования, ТГСК будет лечебным вмешательством независимо от того, получают ли они инфузии NK-клеток или нет. Из-за этих соображений потенциальные преимущества терапии NK-клетками должны перевешивать ее риски для пациентов, подходящих для этого исследования, т. е. пациентов с персистирующей лейкемией, для которых нет других эффективных методов лечения с доказанной эффективностью.

Поскольку CD19 повсеместно экспрессируется на В-клетках, включая ранние предшественники В-клеток, нормальные реципиентные В-клетки также будут мишенью для донорских NK-клеток, трансдуцированных химерными анти-CD19-рецепторами. Таким образом, ожидается транзиторная В-клеточная лимфопения и гипогаммаглобинемия. Мы будем контролировать количество клеток крови CD19+ и измерять уровни Ig один раз в месяц и будем давать участникам внутривенные иммуноглобулины (ВВИГ), если их уровень IgG ниже возрастных диапазонов.

6.0. Резюме дизайна исследования

Клетки периферической крови будут собираться аферезом у доноров. После размножения ex vivo в течение 10 дней путем совместного культивирования с облученными клетками K562-mb15-41BBL (Fujisaki et al., Cancer Res 2009; Lapteva et al. Cytotherapy 2012) и истощение Т-клеток, гаплоидентичные NK-клетки будут подвергнуты электропорации с мРНК анти-CD19-BB-дзета. Перед инфузией пациенты будут получать иммуносупрессивную терапию, чтобы способствовать временному приживлению NK-клеток. После инфузии они получат IL-2 для поддержки жизнеспособности и размножения NK-клеток in vivo. Эффекты инфузии NK-клеток будут определяться путем сравнения уровней MRD до и после лечения.

Экспрессия рецепторов после электропорации носит временный характер и обычно снижается через 48 часов, становясь неопределяемой через 96 часов. Поскольку цель терапии NK-клетками состоит не в том, чтобы вызвать стойкий иммунитет, а в том, чтобы быстро уменьшить нагрузку опухолевыми клетками, а инфузированные NK-клетки отторгаются иммунной системой хозяина примерно через 2 недели инфузии, временный характер экспрессии не должен оказывать существенного влияния. противоопухолевый потенциал. Кроме того, при использовании этой стратегии опасения по поводу безопасности в отношении инсерционного мутагенеза и долгосрочного сохранения трансдуцированных остаточных Т-клеток не применяются. В любом случае мы минимизируем количество остаточных Т-клеток в конечном продукте, насколько это возможно, истощая увеличенный продукт Т-клеток с помощью устройства CliniMACS и ограничивая количество Т-клеток в трансплантате до <0,05 x 10^6/кг.