Pilotstudie zu umgeleiteten haploidentischen Infusionen natürlicher Killerzellen bei akuter lymphatischer Leukämie der B-Linie

1.0. Begründung

Im Gegensatz zu der gut etablierten Zytotoxizität von NK-Zellen gegenüber AML-Zellen ist ihre Fähigkeit, ALL-Zellen zu lysieren, im Allgemeinen gering und schwer vorherzusagen. Wir versuchten, diese intrinsische Resistenz zu überwinden, indem wir CD56+ CD3-NK-Zellen mit chimären Rezeptoren transduzieren, die gegen CD19 gerichtet sind, ein Molekül, das häufig von bösartigen B-Zellen exprimiert wird. Die Expression von Anti-CD19-Rezeptoren, die mit CD3zeta verbunden sind, überwand die NK-Resistenz und verstärkte deutlich die NK-Zell-vermittelte Abtötung von Leukämiezellen. Dieses Ergebnis wurde durch Hinzufügen des kostimulatorischen 4-1BB-Moleküls zum chimären Anti-CD19-CD3zeta-Rezeptor signifikant verbessert: Die von NK-Zellen, die dieses Konstrukt exprimieren, erzeugte Zytotoxizität übertraf einheitlich die von NK-Zellen, deren Signalrezeptoren 4-1BB fehlten, selbst bei natürlicher Zytotoxizität war offensichtlich (Imai et al., Blood 2005). NK-Zellen, die Anti-CD19-Rezeptoren exprimieren, übten auch in einem murinen Leukämiemodell eine starke Anti-ALL-Aktivität aus (Shimasaki et al., Cytotherapy 2012). Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die erzwungene Expression von Signalrezeptoren durch NK-Zellen inhibitorische Signale umgehen könnte, wodurch ein neuartiges Mittel zur Verbesserung der Wirksamkeit der Anti-ALL-NK-Zelltherapie bereitgestellt wird.

Die in unseren präklinischen Studien gezeigte große antileukämische Wirksamkeit genetisch veränderter NK-Zellen zusammen mit der nachgewiesenen Machbarkeit der Infusion dauerhafter haploidentischer NK-Zellen in einem Nicht-HSZT-Setting und der etablierten Expertise des NUH-Teams in der Zelltherapie (das einzige Zentrum in Asien, akkreditiert von der Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy, FACT), bilden eine überzeugende Begründung für die klinische Prüfung dieser NK-Zellen.

Die Herstellung des Schlüsselreagenzes (Anti-CD19-BB-zeta-mRNA) wird im Tissue Engineering & Cell Therapy (TECT) Laboratory der NUH abgeschlossen, wo sich der GMP-konforme MaxCyte-Elektroporator befindet. Die Machbarkeit einer großflächigen Expansion von NK-Zellen wurde demonstriert (Shimasaki et al. Cytotherapy 2012) und die Machbarkeit einer Elektroporation im großen Maßstab, die im TECT-Labor validiert wurde.

Wir werden durchflusszytometrische und MRD-Technologien verwenden, um das Vorhandensein einer persistierenden Erkrankung zu bestimmen, und werden in diese Studie nur Patienten mit einer begrenzten Menge an Resterkrankung einbeziehen (< 1 % leukämische Lymphoblasten unter normalen Knochenmarkzellen). Wir werden dieselben MRD-Methoden verwenden, um die Wirkung von Behandlungsinfusionen zu überwachen. Wir erwarten nicht, dass das Konditionierungsregime selbst eine große Wirkung auf die Zahl der Leukämiezellen haben wird, da die für die Studie geeigneten Patienten eine Krankheit haben werden, die gegen viele Antileukämiemedikamente resistent ist. Da das Konditionierungsregime selbst einige heilsame Wirkungen haben kann, ist es dennoch wichtig, das periphere Blut und/oder Knochenmark während aller Stadien des Verfahrens, d. h. vor, während und nach der Konditionierung, auf das Vorhandensein von leukämischen Blastenzellen zu untersuchen und nach der NK-Zell-Infusion. Das Vorhandensein von Leukämiezellen in wird durch Durchflusszytometrie oder PCR-Amplifikation von Antigen-Rezeptor-Genen (Sensitivität für beide Methoden: 1 Leukämiezelle von 10.000) genau überwacht, um etwas Licht auf die relative Wirkung jeder Intervention zu werfen.

2.0. Hypothese und Ziele

Die Haupthypothese, die in dieser Studie getestet werden soll, ist, dass die Infusion von NK-Zellen, die Anti-CD19-BB-zeta-Rezeptoren exprimieren, durch Elektroporation messbare klinische Reaktionen bei Patienten mit resistenter ALL der B-Linie hervorrufen kann.

3.0. Hauptziele

• Bestimmung der Durchführbarkeit und Sicherheit der Umleitung von NK-Zellen mit einem chimären Antigenrezeptor gegen CD19 durch mRNA-Elektroporation in einem klinischen Umfeld.
• Bestimmung der Wirksamkeit von Anti-CD19-umgeleiteten NK-Zellen bei Forschungsteilnehmern mit ALL der B-Linie, die eine anhaltende Krankheit haben, wie durch MRD-Methoden nach intensiver Chemotherapie bestimmt.

4.0. Sekundäre Ziele

• Es sollten die Persistenz und der Phänotyp umgeleiteter NK-Zellen bei Forschungsteilnehmern mit ALL der B-Linie untersucht werden, die nach intensiver Chemotherapie eine Resterkrankung aufweisen.

5.0. Endpunkte

In dieser Studie wird das Ansprechen auf die Behandlung durch Vergleich der MRD-Spiegel vor und in mehreren Intervallen nach der NK-Zell-Infusion gemessen. Das Erreichen einer MRD-Negativität im Knochenmark, d. h. < 0,01 % Blasten durch Durchflusszytometrie oder PCR, wird als vollständiges Ansprechen betrachtet . Partielles Ansprechen wird als ≥ 1 log Abnahme der MRD-Spiegel definiert, während eine Abnahme der MRD-Spiegel < 1 log als keine Reaktion angesehen wird.

Basierend auf früheren Studien werden Spender-NK-Zellen in den meisten Fällen durch die wiederauflebende zelluläre Immunität des haploidentischen Empfängers eliminiert, nachdem die Wirkungen der vorübergehenden Immunsuppression, die durch das Konditionierungsschema verursacht wurde, aufgehört haben (typischerweise innerhalb von 1 Monat nach der Infusion). Es ist jedoch denkbar, dass die Anpflanzung von NK-Zellen über einen längeren Zeitraum bestehen bleibt, mit dem möglichen Risiko einer verlängerten Panzytopenie aufgrund der Abtötung von NK-Zellen auf normalen hämatopoetischen Zellen. Aufgrund dieser Möglichkeit planen wir eine HSCT-Rettung bei Patienten, die umgeleitete NK-Zell-Infusionen erhalten. Tatsächlich wäre die HSZT für die meisten Patienten, die für diese Studie geeignet sind, die Behandlungsintervention, unabhängig davon, ob sie NK-Zell-Infusionen erhalten oder nicht. Aufgrund dieser Überlegungen sollten die potenziellen Vorteile der NK-Zelltherapie ihre Risiken für die für diese Studie in Frage kommenden Patienten überwiegen, d. h. Patienten mit persistierender Leukämie, für die keine andere nachweislich wirksame Behandlung verfügbar ist.

Da CD19 universell auf B-Zellen exprimiert wird, einschließlich früher B-Zell-Vorläufer, werden normale Empfänger-B-Zellen auch ein Ziel für die Spender-NK-Zellen sein, die mit den chimären Anti-CD19-Rezeptoren transduziert sind. Daher sind vorübergehende B-Zell-Lymphopenie und Hypogammaglobinämie zu erwarten. Wir überwachen die Anzahl der CD19+-Blutzellen und messen die Ig-Werte einmal im Monat und verabreichen den Teilnehmern intravenöse Immunglobuline (IVIG), wenn ihr IgG-Wert niedriger als die altersspezifischen Bereiche ist.

6.0. Zusammenfassung des Studiendesigns

Periphere Blutzellen werden durch Apherese von Spendern gesammelt. Nach 10-tägiger Ex-vivo-Expansion durch Kokultur mit bestrahlten K562-mb15-41BBL-Zellen (Fujisaki et al, Cancer Res 2009; Lapteva et al. Cytotherapy 2012) und T-Zell-Depletion werden haploidentische NK-Zellen mit anti-CD19-BB-zeta-mRNA elektroporiert. Vor der Infusion erhalten die Patienten eine immunsuppressive Therapie, um die vorübergehende Transplantation von NK-Zellen zu fördern. Nach der Infusion erhalten sie IL-2, um die Lebensfähigkeit und Expansion von NK-Zellen in vivo zu unterstützen. Die Wirkungen der NK-Zell-Infusion werden durch Vergleich der MRD-Spiegel vor und nach der Behandlung bestimmt.

Die Rezeptorexpression nach der Elektroporation ist vorübergehend und nimmt typischerweise nach 48 Stunden ab und wird nach 96 Stunden nicht mehr nachweisbar. Da das Ziel der NK-Zelltherapie nicht darin besteht, eine dauerhafte Immunität zu induzieren, sondern die Tumorzellbelastung schnell zu verringern, und die infundierten NK-Zellen vom Immunsystem des Wirts nach etwa 2 Wochen der Infusion abgestoßen werden, sollte die vorübergehende Natur der Expression keinen signifikanten Einfluss haben Anti-Tumor-Potenzial. Darüber hinaus gelten bei Verwendung dieser Strategie keine Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Insertionsmutagenese und der langfristigen Persistenz von transduzierten restlichen T-Zellen. In jedem Fall werden wir die Anzahl der restlichen T-Zellen im Endprodukt so weit wie möglich minimieren, indem wir das expandierte Produkt der T-Zellen mithilfe des CliniMACS-Geräts abbauen und die Anzahl der T-Zellen im Transplantat auf <0,05 x begrenzen 10^6/kg.