Estudo piloto de infusões de células assassinas naturais haploidênticas redirecionadas para leucemia linfoblástica aguda de linhagem B

1.0. Justificativa

Em contraste com a citotoxicidade bem estabelecida das células NK contra células AML, sua capacidade de lisar células ALL é geralmente baixa e difícil de prever. Buscamos superar essa resistência intrínseca transduzindo células CD56+ CD3- NK com receptores quiméricos direcionados contra CD19, molécula amplamente expressa por células B malignas. A expressão de receptores anti-CD19 ligados a CD3zeta superou a resistência NK e aumentou acentuadamente a morte mediada por células NK de células leucêmicas. Esse resultado foi significativamente melhorado pela adição da molécula coestimuladora 4-1BB ao receptor quimérico anti-CD19-CD3zeta: a citotoxicidade produzida pelas células NK que expressam esse construto excedeu uniformemente a das células NK cujos receptores de sinalização não tinham 4-1BB, mesmo quando a citotoxicidade natural era aparente (Imai et al., Blood 2005). As células NK que expressam receptores anti-CD19 também exerceram vigorosa atividade anti-ALL em um modelo murino de leucemia (Shimasaki et al., Cytotherapy 2012). Nossos achados indicam que a expressão forçada de receptores de sinalização pelas células NK pode contornar os sinais inibitórios, fornecendo um novo meio para aumentar a eficácia da terapia com células NK anti-ALL.

A grande eficácia antileucêmica das células NK geneticamente modificadas mostrada em nossos estudos pré-clínicos, juntamente com a viabilidade demonstrada de infundir células NK haploidênticas duráveis ​​em um ambiente não HSCT e a experiência estabelecida pela equipe do NUH em terapia celular (o único centro em Asia credenciada pela Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy, FACT), formam uma justificativa convincente para o teste clínico dessas células NK.

A preparação do reagente chave (mRNA anti-CD19-BB-zeta) é finalizada no Laboratório de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular (TECT) do NUH, onde está localizado o eletroporador MaxCyte compatível com GMP. A viabilidade da expansão em larga escala das células NK foi demonstrada (Shimasaki et al. Cytotherapy 2012), e a viabilidade da eletroporação em larga escala validada no laboratório TECT.

Usaremos tecnologias de citometria de fluxo e MRD para determinar a presença de doença persistente e incluiremos neste estudo apenas pacientes com uma quantidade limitada de doença residual (<1% de linfoblastos leucêmicos entre células normais da medula óssea). Usaremos os mesmos métodos MRD para monitorar os efeitos das infusões de tratamento. Não esperamos que o regime de condicionamento tenha muito efeito por si só nas contagens de células leucêmicas, pois os pacientes elegíveis para o estudo terão doença resistente a muitos medicamentos antileucêmicos. No entanto, como o próprio regime de condicionamento pode ter alguns efeitos salutares, será importante rastrear o sangue periférico e/ou a medula óssea quanto à presença de células blásticas leucêmicas em todos os estágios do procedimento, ou seja, antes, durante e após o condicionamento e após a infusão de células NK. A presença de células leucêmicas será monitorada de perto por citometria de fluxo ou amplificação por PCR de genes receptores de antígenos (sensibilidade para qualquer um dos métodos: 1 célula leucêmica em 10.000) para lançar alguma luz sobre o efeito relativo de cada intervenção.

2.0. Hipótese e Objetivos

A principal hipótese a ser testada neste estudo é que a infusão de células NK expressando receptores anti-CD19-BB-zeta por eletroporação pode produzir respostas clínicas mensuráveis ​​em pacientes com LLA de linhagem B resistente.

3.0. Objetivos primários

• Determinar a viabilidade e segurança do redirecionamento de células NK com um receptor de antígeno quimérico anti-CD19 por eletroporação de mRNA em um ambiente clínico.
• Determinar a eficácia das células NK redirecionadas anti-CD19 em participantes de pesquisa com LLA de linhagem B que têm doença persistente conforme determinado por métodos MRD após quimioterapia intensiva.

4.0. Objetivos Secundários

• Estudar a persistência e o fenótipo das células NK redirecionadas em participantes de pesquisa com LLA de linhagem B que apresentam doença residual após quimioterapia intensiva.

5.0. Terminais

Neste estudo, a resposta ao tratamento será medida comparando os níveis de MRD antes e em vários intervalos após a infusão de células NK. A obtenção de negatividade de MRD na medula óssea, ou seja, < 0,01% de blastos por citometria de fluxo ou PCR, será considerada uma resposta completa . A resposta parcial será definida como ≥ 1 log de diminuição nos níveis de MRD, enquanto < 1 log de diminuição nos níveis de MRD será considerada como sem resposta.

Com base em estudos anteriores, as células NK do doador serão eliminadas na maioria dos casos pela imunidade celular ressurgente do receptor haploidêntico após cessarem os efeitos da imunossupressão transitória causada pelo regime de condicionamento (normalmente dentro de 1 mês após a infusão). Concebivelmente, no entanto, o enxerto de células NK pode persistir por um período mais longo com o possível risco de pancitopenia prolongada devido à morte de células NK em células hematopoiéticas normais. Devido a essa possibilidade, planejaremos o resgate do HSCT em pacientes que recebem infusões de células NK redirecionadas. De fato, para a maioria dos pacientes elegíveis para este estudo, o TCTH seria a intervenção de tratamento, independentemente de receberem ou não infusões de células NK. Devido a essas considerações, os benefícios potenciais da terapia com células NK devem superar seus riscos para os pacientes elegíveis para este estudo, ou seja, pacientes com leucemia persistente para os quais nenhum outro tratamento eficaz comprovado está disponível.

Como o CD19 é expresso universalmente em células B, incluindo precursores de células B iniciais, as células B receptoras normais também serão um alvo para as células NK doadoras transduzidas com os receptores quiméricos anti-CD19. Portanto, são esperadas linfopenia transitória de células B e hipogamaglobinemia. Monitoraremos a contagem de células sanguíneas CD19+ e mediremos os níveis de Ig uma vez por mês e daremos aos participantes imunoglobulinas intravenosas (IVIG) se o nível de IgG for inferior aos intervalos específicos da idade.

6.0. Resumo do desenho do estudo

Células de sangue periférico serão coletadas por aférese de doadores. Após expansão ex vivo por 10 dias por cocultura com células K562-mb15-41BBL irradiadas (Fujisaki et al, Cancer Res 2009; Lapteva et al. Cytotherapy 2012) e depleção de células T, células NK haploidênticas serão eletroporadas com mRNA anti-CD19-BB-zeta. Antes da infusão, os pacientes receberão terapia imunossupressora para promover o enxerto temporário de células NK. Após a infusão, eles receberão IL-2 para suportar a viabilidade e expansão das células NK in vivo. Os efeitos da infusão de células NK serão determinados comparando os níveis de MRD antes e após o tratamento.

A expressão do receptor após a eletroporação é transitória e normalmente diminui após 48 horas, tornando-se indetectável após 96 horas. Como o objetivo da terapia com células NK não é induzir imunidade durável, mas reduzir rapidamente a carga de células tumorais, e as células NK infundidas são rejeitadas pelo sistema imunológico do hospedeiro após aproximadamente 2 semanas de infusão, a natureza transitória da expressão não deve afetar significativamente potencial antitumoral. Além disso, ao usar esta estratégia, as preocupações de segurança em relação à mutagênese insercional e persistência a longo prazo de células T residuais transduzidas não se aplicam. Em qualquer caso, vamos minimizar o número de células T residuais no produto final, tanto quanto possível, esgotando o produto expandido de células T usando o dispositivo CliniMACS e limitando o número de células T no enxerto para <0,05 x 10^6/kg.