B 系急性淋巴细胞白血病重定向单倍相合自然杀伤细胞输注的初步研究

1.0。基本原理

与 NK 细胞对 AML 细胞的公认细胞毒性相反，它们裂解 ALL 细胞的能力通常很低且难以预测。 我们试图通过使用针对 CD19 的嵌合受体转导 CD56+ CD3- NK 细胞来克服这种内在耐药性，CD19 是一种在恶性 B 细胞中广泛表达的分子。 与 CD3zeta 相关的抗 CD19 受体的表达克服了 NK 耐药性并显着增强了 NK 细胞介导的白血病细胞杀伤。 通过将 4-1BB 共刺激分子添加到嵌合抗 CD19-CD3zeta 受体中，这一结果得到了显着改善：表达这种结构的 NK 细胞产生的细胞毒性均匀超过其信号受体缺乏 4-1BB 的 NK 细胞，即使在自然细胞毒性时也是如此很明显（Imai 等人，Blood 2005）。 表达抗 CD19 受体的 NK 细胞也在白血病小鼠模型中发挥了强烈的抗 ALL 活性（Shimasaki 等人，Cytotherapy 2012）。 我们的研究结果表明，NK 细胞强制表达信号受体可能会规避抑制信号，为增强抗 ALL NK 细胞疗法的有效性提供了一种新方法。

我们的临床前研究显示了转基因 NK 细胞的强大抗白血病功效，以及在非 HSCT 环境中输注持久的半相合 NK 细胞的可行性以及 NUH 团队在细胞治疗方面的成熟专业知识（唯一的中心）细胞治疗认证基金会 (FACT) 认可的亚洲）为这些 NK 细胞的临床测试提供了令人信服的理由。

关键试剂（抗 CD19-BB-zeta mRNA）的制备在 NUH 的组织工程与细胞治疗 (TECT) 实验室完成，那里有符合 GMP 标准的 MaxCyte 电穿孔仪。 大规模扩增 NK 细胞的可行性已经得到证实（Shimasaki 等人，2007 年）。 Cytotherapy 2012)，以及在 TECT 实验室验证的大规模电穿孔的可行性。

我们将使用流式细胞术和 MRD 技术来确定持续性疾病的存在，并且在本研究中将仅包括具有有限残留疾病（正常骨髓细胞中白血病淋巴母细胞 <1%）的患者。 我们将使用相同的 MRD 方法来监测治疗输液的效果。 我们预计预处理方案本身不会对白血病细胞计数产生太大影响，因为符合研究条件的患者将患有对许多抗白血病药物具有耐药性的疾病。 然而，由于调理方案本身可能有一些有益效果，因此在整个过程的所有阶段（即调理之前、期间和之后）筛查外周血和/或骨髓中是否存在白血病母细胞非常重要和 NK 细胞输注后。 白血病细胞的存在将通过流式细胞术或抗原-受体基因的 PCR 扩增（两种方法的敏感性：10,000 个白血病细胞）密切监测，以阐明每种干预措施的相对影响。

2.0。假设和目标

本研究要检验的主要假设是，通过电穿孔输注表达抗 CD19-BB-zeta 受体的 NK 细胞可以在耐药 B 系 ALL 患者中产生可测量的临床反应。

3.0。主要目标

• 确定在临床环境中通过 mRNA 电穿孔用抗 CD19 嵌合抗原受体重定向 NK 细胞的可行性和安全性。
• 确定抗 CD19 重定向 NK 细胞在 B 系 ALL 研究参与者中的疗效，这些参与者在强化化疗后通过 MRD 方法确定患有持续性疾病。

4.0。次要目标

• 研究重定向 NK 细胞在强化化疗后有残留病灶的 B 系 ALL 研究参与者中的持久性和表型。

5.0。端点

在这项研究中，将通过比较 NK 细胞输注之前和之后的几个时间间隔的 MRD 水平来测量治疗反应。骨髓中 MRD 阴性的实现，即通过流式细胞术或 PCR 获得 < 0.01% 原始细胞，将被视为完全反应. 部分反应将被定义为 MRD 水平下降 ≥ 1 log，而 MRD 水平下降 < 1 log 将被视为无反应。

根据之前的研究，在大多数情况下，供体 NK 细胞会在预处理方案引起的短暂免疫抑制作用停止后（通常在输注后 1 个月内）被半相合受体的细胞免疫复活消除。 然而，可以想象的是，NK 细胞植入可能会持续更长的时间，并且由于 NK 细胞对正常造血细胞的杀伤，可能存在长期全血细胞减少症的风险。 由于这种可能性，我们将计划对接受重定向 NK 细胞输注的患者进行 HSCT 挽救。 事实上，对于大多数符合这项研究条件的患者，HSCT 将是治疗干预，无论他们是否接受 NK 细胞输注。 由于这些考虑，NK 细胞疗法的潜在益处应该超过其对符合本研究条件的患者的风险，即没有其他有效治疗方法的持续性白血病患者。

由于 CD19 在包括早期 B 细胞前体在内的 B 细胞上普遍表达，因此正常受体 B 细胞也将成为用抗 CD19 嵌合受体转导的供体 NK 细胞的靶标。 因此，预计会出现短暂的 B 细胞淋巴细胞减少症和低丙种球蛋白血症。 我们将监测 CD19+ 血细胞计数并每月测量一次 Ig 水平，如果参与者的 IgG 水平低于特定年龄范围，我们将给他们静脉注射免疫球蛋白 (IVIG)。

6.0。研究设计总结

外周血细胞将通过单采术从捐赠者处收集。 通过与受照射的 K562-mb15-41BBL 细胞共培养离体扩增 10 天后（Fujisaki 等人，Cancer Res 2009；Lapteva 等人。 Cytotherapy 2012) 和 T 细胞耗竭，半相合 NK 细胞将用抗 CD19-BB-zeta mRNA 进行电穿孔。 在输注之前，患者将接受免疫抑制治疗以促进 NK 细胞的临时植入。 输注后，他们将接受 IL-2 以支持 NK 细胞在体内的活力和扩增。 NK 细胞输注的效果将通过比较治疗前后的 MRD 水平来确定。

电穿孔后的受体表达是短暂的，通常在 48 小时后下降，在 96 小时后变得检测不到。 因为 NK 细胞治疗的目的不是诱导持久免疫，而是快速减轻肿瘤细胞负荷，并且输注的 NK 细胞在输注约 2 周后会被宿主免疫系统排斥，因此表达的瞬时性不会显着影响抗肿瘤潜力。 此外，通过使用该策略，关于插入诱变和转导残留 T 细胞长期持续存在的安全问题不适用。 在任何情况下，我们都将通过使用 CliniMACS 设备耗尽 T 细胞的扩增产物，并将移植物中的 T 细胞数量限制在 <0.05 x，从而尽可能减少最终产品中残留的 T 细胞数量10^6/公斤。