Pilotní studie infuzí přesměrovaných haploidentických přirozených zabíječských buněk pro akutní lymfoblastickou leukémii B-linie

1,0. Odůvodnění

Na rozdíl od dobře zavedené cytotoxicity NK buněk proti AML buňkám je jejich kapacita lyžovat VŠECHNY buňky obecně nízká a obtížně předvídatelná. Snažili jsme se překonat tuto vnitřní rezistenci transdukcí CD56+ CD3-NK buněk chimérickými receptory namířenými proti CD19, molekule široce exprimované maligními B buňkami. Exprese anti-CD19 receptorů spojených s CD3zeta překonala NK rezistenci a výrazně zvýšila NK buňkami zprostředkované zabíjení leukemických buněk. Tento výsledek byl významně zlepšen přidáním kostimulační molekuly 4-1BB k chimérickému anti-CD19-CD3zeta receptoru: cytotoxicita produkovaná NK buňkami exprimujícími tento konstrukt rovnoměrně převyšovala cytotoxicitu NK buněk, jejichž signální receptory postrádaly 4-1BB, i když přirozená cytotoxicita bylo zřejmé (Imai et al., Blood 2005). NK buňky exprimující anti-CD19 receptory také projevovaly silnou anti-ALL aktivitu v myším modelu leukémie (Shimasaki et al., Cytotherapy 2012). Naše zjištění naznačují, že vynucená exprese signalizačních receptorů NK buňkami by mohla obejít inhibiční signály, což poskytuje nový prostředek ke zvýšení účinnosti anti-ALL NK buněčné terapie.

Velká antileukemická účinnost geneticky modifikovaných NK buněk prokázaná v našich preklinických studiích spolu s prokázanou proveditelností infuze odolných haploidentických NK buněk v prostředí bez HSCT a zavedenými odbornými znalostmi týmu NUH v oblasti buněčné terapie (jediné centrum v Asie akreditovaná Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy, FACT), tvoří přesvědčivý důvod pro klinické testování těchto NK buněk.

Příprava klíčového činidla (anti-CD19-BB-zeta mRNA) je dokončena v laboratoři Tissue Engineering & Cell Therapy (TECT) na NUH, kde je umístěn elektroporátor MaxCyte vyhovující GMP. Byla prokázána proveditelnost expanze NK buněk ve velkém měřítku (Shimasaki et al. Cytoterapie 2012) a proveditelnost elektroporace ve velkém měřítku ověřená v laboratoři TECT.

Ke stanovení přítomnosti perzistujícího onemocnění využijeme technologie průtokové cytometrie a MRD a do této studie zařadíme pouze pacienty s omezeným množstvím reziduálního onemocnění (<1 % leukemických lymfoblastů mezi normálními buňkami kostní dřeně). Ke sledování účinků léčebných infuzí použijeme stejné metody MRD. Neočekáváme, že přípravný režim bude mít sám o sobě velký vliv na počty leukemických buněk, protože pacienti způsobilí pro studii budou mít onemocnění, které je odolné vůči mnoha antileukemickým lékům. Nicméně, protože samotný kondicionační režim může mít určité blahodárné účinky, bude důležité provést screening periferní krve a/nebo kostní dřeně na přítomnost leukemických blastových buněk ve všech fázích postupu, tj. před, během a po kondicionování. a po infuzi NK buněk. Přítomnost leukemických buněk v bude pečlivě monitorována průtokovou cytometrií nebo PCR amplifikací genů pro antigen-receptory (citlivost pro obě metody: 1 leukemická buňka z 10 000), aby se osvětlil relativní účinek každé intervence.

2,0. Hypotéza a cíle

Hlavní hypotéza, která má být testována v této studii, je, že infuze NK buněk exprimujících anti-CD19-BB-zeta receptory elektroporací může vyvolat měřitelné klinické odpovědi u pacientů s rezistentní ALL B-linií.

3.0. Primární cíle

• Stanovit proveditelnost a bezpečnost přesměrování NK buněk s anti-CD19 chimérickým antigenním receptorem elektroporací mRNA v klinickém prostředí.
• Stanovit účinnost anti-CD19 přesměrovaných NK buněk u účastníků výzkumu s ALL B-linií, kteří mají přetrvávající onemocnění, jak bylo stanoveno metodami MRD po intenzivní chemoterapii.

4,0. Sekundární cíle

• Studovat persistenci a fenotyp přesměrovaných NK buněk u účastníků výzkumu s ALL B-linií, kteří mají reziduální onemocnění po intenzivní chemoterapii.

5,0. Koncové body

V této studii bude odpověď na léčbu měřena porovnáním hladin MRD před a v několika intervalech po infuzi NK buněk. Dosažení MRD negativity v kostní dřeni, tj. < 0,01 % blastů pomocí průtokové cytometrie nebo PCR, bude považováno za kompletní odpověď . Částečná odpověď bude definována jako ≥ 1 log pokles hladin MRD, zatímco < 1 log pokles hladin MRD bude považován za žádnou odpověď.

Na základě předchozích studií budou dárcovské NK buňky ve většině případů eliminovány obnovenou buněčnou imunitou haploidentického příjemce poté, co ustanou účinky přechodné imunosuprese způsobené přípravným režimem (typicky do 1 měsíce od infuze). Je však možné, že přihojení NK buněk může přetrvávat delší dobu s možným rizikem prodloužené pancytopenie v důsledku zabíjení NK buněk na normálních hematopoetických buňkách. Kvůli této možnosti budeme plánovat záchranu HSCT u pacientů, kteří dostávají přesměrované infuze NK buněk. Ve skutečnosti by pro většinu pacientů vhodných pro tuto studii byla HSCT léčebnou intervencí bez ohledu na to, zda dostávají infuze NK buněk nebo ne. Vzhledem k těmto úvahám by potenciální přínosy terapie NK buňkami měly převážit její rizika pro pacienty vhodné pro tuto studii, tj. pacienty s přetrvávající leukémií, pro které není dostupná žádná jiná prokázaná účinná léčba.

Protože CD19 je univerzálně exprimován na B buňkách včetně časných prekurzorů B buněk, normální recipientní B buňka bude také cílem pro donorové NK buňky transdukované anti-CD19 chimérickými receptory. Proto se očekává přechodná B-buněčná lymfopenie a hypogamaglobinémie. Budeme monitorovat počet krvinek CD19+ a měřit hladiny Ig jednou měsíčně a účastníkům budeme podávat intravenózní imunoglobuliny (IVIG), pokud je jejich hladina IgG nižší než věkově specifické rozmezí.

6.0. Shrnutí návrhu studie

Periferní krvinky budou odebírány aferézou od dárců. Po ex vivo expanzi po dobu 10 dnů kokultivací s ozářenými buňkami K562-mb15-41BBL (Fujisaki et al, Cancer Res 2009; Lapteva et al. Cytoterapie 2012) a deplece T-buněk, haploidentické NK buňky budou elektroporovány anti-CD19-BB-zeta mRNA. Před infuzí dostanou pacienti imunosupresivní léčbu k podpoře dočasného přihojení NK buněk. Po infuzi dostanou IL-2 na podporu životaschopnosti a expanze NK buněk in vivo. Účinky infuze NK buněk budou stanoveny porovnáním hladin MRD před a po léčbě.

Exprese receptoru po elektroporaci je přechodná a typicky klesá po 48 hodinách a stává se nedetekovatelnou po 96 hodinách. Vzhledem k tomu, že cílem terapie NK buňkami není navození trvalé imunity, ale rychlé snížení zátěže nádorových buněk a NK buňky podané infuzí jsou imunitním systémem hostitele odmítnuty přibližně po 2 týdnech infuze, přechodná povaha exprese by neměla významně ovlivnit protinádorový potenciál. Navíc při použití této strategie neplatí bezpečnostní obavy týkající se inzerční mutageneze a dlouhodobé perzistence transdukovaných reziduálních T buněk. V každém případě minimalizujeme počet zbytkových T buněk v konečném produktu na co nejvyšší možnou míru vyčerpáním expandovaného produktu T buněk pomocí zařízení CliniMACS a omezením počtu T buněk ve štěpu na < 0,05 x 10^6/kg.